RP-HPLC法分析爪蟾卵母細(xì)胞膜磷脂PIP-,2-含量的研究.pdf

1、磷脂是細(xì)胞膜特有組分，主要包括卵磷脂、腦磷脂、肌醇磷脂，其中肌醇磷脂尤其是磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate，PIP<,2>) 在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用。PIP<,2>占細(xì)胞膜總磷脂的含量很少(不到1％)，但卻在胞內(nèi)第二信使的產(chǎn)生、胞吐與胞飲調(diào)控、細(xì)胞骨架與胞膜貼附等一系列細(xì)胞的生理過程及生命活動中發(fā)揮著重要作用。此外，PIP<,2>還可以調(diào)控很多離子轉(zhuǎn)運(yùn)體和離子通道的功能，如N

2、a/Ca交換體，Na/H交換體，電壓門控性鈣離子通道，TRP通道，內(nèi)向整流性鉀離子通道(Kir通道)以及KCNQ通道等。PIP<,2>的代謝在對離子通道的功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。近年研究表明，神經(jīng)遞質(zhì)、蛋白激酶、pH值、帶電離子、藥物、脂類代謝物等均可作為調(diào)節(jié)因素調(diào)節(jié)離子通道的功能，而上述調(diào)節(jié)因素可能通過影響細(xì)胞膜磷脂PIP<,2>與離子通道的相互作用而影響通道功能，PIP<,2>可能是決定離子通道功能調(diào)節(jié)的最終的關(guān)鍵因素。因此對PIP

3、<,2>的定量研究對于探討其在離子通道的調(diào)控機(jī)制方面具有重要意義，可為研究PIP<,2>代謝在離子通道功能調(diào)節(jié)中的作用提供直接的證據(jù)。 對于膜磷脂PIP<,2>的定量，以往大部分都采用傳統(tǒng)的放射性同位素標(biāo)記的方法，或者采用衍生化的方法對PIP<,2>的結(jié)構(gòu)進(jìn)行再修飾，以提高其檢測靈敏度，然后采用離子抑制電導(dǎo)檢測或紫外檢測的方法進(jìn)行液相色譜分析。本實驗建立了一種直接有效分離并檢測細(xì)胞膜磷脂PIP<,2>的新方法一反相高效液相色譜法

4、，并結(jié)合藥理學(xué)方法、液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)和激光共聚焦掃描技術(shù)對該方法的準(zhǔn)確性和可靠性進(jìn)行了進(jìn)一步驗證。目的：建立并驗證一種直接有效測定爪蟾卵母細(xì)胞膜磷脂PIP<,2>含量變化的反相高效液相色譜方法。 方法：(1) 高效液相色譜方法的建立：主要色譜條件：色譜柱為Diamonsil C18柱(2.50mm×4.6mm，5μm)，保護(hù)柱為Diamonsil C18柱(4mm×4.6mm，5μm)，流動相為甲醇一乙腈-水 (40∶40∶20，

5、v/v/v)，以1.0ml/min進(jìn)行等梯度洗脫，紫外檢測波長205nm，柱溫25℃。(2)高效液相色譜方法對爪蟾卵母細(xì)胞膜磷脂PIP<,2>含量變化的測定，即藥理學(xué)方法對PIP<,2>色譜峰的定性確證：用 wortmannin(μM水平可阻斷PI<,4>K激酶，抑制PIP<,2>的合成)孵育爪蟾卵母細(xì)胞兩小時后，加入1ml裂解緩沖液勻漿，以5500rpm低速離心5min，取上清液，再以17500rpm高速離心2h，棄上清液，沉淀加入5

6、0μl裂解緩沖液制成懸浮液。懸浮液加入900μl氯仿-甲醇(9∶1，v/v)提取細(xì)胞膜磷脂，以反相高效液相色譜技術(shù)分析 wortmannin處理組和空白對照組 (未用 wortmannin孵育)膜磷脂 PIP<,2>的含量變化。樣品和標(biāo)準(zhǔn)對照品均用甲醇-乙腈-水 (40∶4.0∶20，v/v/v)，即流動相溶解，進(jìn)樣量：20μl。(3)應(yīng)用液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對標(biāo)準(zhǔn)對照品PIP<,2>和細(xì)胞膜磷脂PIP<,2>的色譜峰進(jìn)行進(jìn)一步定性確證。標(biāo)準(zhǔn)

7、品溶液和樣品溶液配制方法同前，液相色譜條件同前，主要質(zhì)譜條件：離子源類型：Turbo Spray 電噴霧式；電離方式：負(fù)離子模式；掃描類型：Q1 全掃描模式。(4)應(yīng)用激光共聚焦掃描方法對所建立色譜方法的進(jìn)一步驗證：將克隆于pOMU質(zhì)粒載體中的PLC<,δ1>PH-GFP質(zhì)粒DNA用Xba Ⅰ限制性內(nèi)切酶線性化，用Ribomax<'TM> LargeScale RNA Production Systems T7 Kit 體外轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的

8、cRNA，用微注射的方法按每個卵母細(xì)胞50nl注射，注射后的細(xì)胞在含2.5raM丙酮酸鈉的ND96液中19-20℃培養(yǎng)，表達(dá)24小時后用wortmannin孵育細(xì)胞兩小時，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞膜PIP<,2>水解情況，并與空白對照(未用wortmannin孵育)進(jìn)行比較，觀察細(xì)胞膜磷脂PIP<,2>的含量變化。 結(jié)果：(1)應(yīng)用建立的RP-HPLC法能夠有效分離出細(xì)胞膜磷脂PIP<,2>并檢測出其含量變化。PIP<,2>的保

9、留時間為2.1min，在 0.025～0.3μg/μl濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為v=100.09x+0.7483(r=0.9979)，最小檢測限為6.25×10<'-3>μg/μl。精密度試驗測得色譜峰高的RSD為6.0％，重復(fù)性試驗測得色譜峰高的RSD為5.7％，均符合生物樣品分析要求。(2)本實驗每組均從50個爪蟾卵母細(xì)胞中提取膜磷脂，最后以100μl溶劑溶解進(jìn)樣分析，每次進(jìn)樣20μl，測得未用wortmannin預(yù)孵育的爪

10、蟾卵母細(xì)胞，即空白對照組，PIP<,2>的色譜峰高為11.16±0.28(n=5)，而以10μM wortmannin預(yù)孵育爪蟾卵母細(xì)胞兩小時的實驗組，PIP<,2>的峰高值明顯下降，其色譜峰高為5.30±0.13(n=5)，兩組存在顯著差異(P<0.01)，峰高下降率達(dá)52.5％。(3)應(yīng)用液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在相同的出峰時間分別測定標(biāo)準(zhǔn)品PIP<,2>和爪蟾卵母細(xì)胞膜磷脂樣品中PIP<,2>的質(zhì)譜圖，所得的質(zhì)譜圖吻合較好，其中m/z181

11、，m/z233，m/z249，m/z317，m/z369，m/z385，m/z453，m/z589，m/z=657，m/z673，m/z725，m/z809等質(zhì)譜峰在兩個來e源的受試品種完全吻合，且在二者的質(zhì)譜圖中均得到了 PIP<,2>的特征質(zhì)譜峰。在標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖中，主要的特征質(zhì)譜峰有：m/z1133 ([M-5H+4Na]<'->)，m/z 929([M-1-H<,3>PO<,4>-H<,2>O]<'->)，m/z521 ([M-2

12、H]<'2->)，m/z 437，m/z 369([M-2H-R<,2>COOH]<'2->)；在樣品質(zhì)譜圖中，主要的特征質(zhì)譜峰有：m/z 741([M-2H-R<,2>COO<'->]<'->)，m/z 401，m/z 369 ([M-2H-R<,2>COOH]<'2->)，m/z 348([M-3H]<'3->)。(4)向卵母細(xì)胞注射cRNA表達(dá)24小時后，再以10μg wortmannin孵育兩小時，LSCM觀察爪蟾卵母細(xì)胞膜磷脂

13、PIP<,2>的含量變化：未用wortmannin預(yù)孵育但表達(dá)有 PLC<,δ1>PH-GFP 的空白對照組細(xì)胞膜處的綠色熒光強(qiáng)度均值為127.90±3.6(n=7)；而以10μM wortmannin預(yù)孵育表達(dá)有 PLC<,δ1>PH-GFP 的爪蟾卵母細(xì)胞兩小時的實驗組，細(xì)胞膜處的綠色熒光強(qiáng)度明顯減弱，熒光強(qiáng)度均值為63.74±4.3 (n=6)，兩組存在顯著差異 (P<0.01)，熒光強(qiáng)度下降率達(dá)到 50.2％。 結(jié)論：本