ACTION MECHANISM OF RNAi MEDIATED KNOCKDOWN OF INHIBINα SUBUNIT ON APOPTOSIS OF GRANULIOSA CELLS AND FERTILITY IN MOUSE.pdf

1、抑制素α(INHα)是TGFβ超家族的成員之一、生殖功能的重要調(diào)節(jié)劑，在卵泡發(fā)育、細(xì)胞分化以及卵母細(xì)胞發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用，從而影響動(dòng)物的繁殖性能。為研究INHα在動(dòng)物繁殖中作用與機(jī)理，在本實(shí)驗(yàn)室前期研究中，利用shRNAi技術(shù)分別構(gòu)建了水牛INHα基因RNAi-B和小鼠INHα基因RNAi-M，并分別獲得了INHα基因沉默的RNAi-INHα轉(zhuǎn)基因小鼠（RNAi-B轉(zhuǎn)基因小鼠和RNAi-M轉(zhuǎn)基因小鼠）;本試驗(yàn)以該轉(zhuǎn)基因小鼠為對(duì)象開

2、展研究，主要結(jié)果如下:
　　(1)轉(zhuǎn)基因小鼠的INHα基因表達(dá)的分析:轉(zhuǎn)基因小鼠的INHα基因的mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平和蛋白翻譯水平都受到了干擾抑制，其中RNAi-M轉(zhuǎn)基因小鼠的INHα基因mRNA表達(dá)水平的抑制率為64％、RNAi-B抑制率為44％;
　　由于RNAi-M轉(zhuǎn)基因小鼠的INHα基因抑制水平較高，而且RNAi-M是根據(jù)小鼠INHα基因序列設(shè)計(jì)的，故選擇RNAi-M轉(zhuǎn)基因小鼠作為對(duì)象開展以下研究的:
　　(2

3、)轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)仔性能的探討:RNAi-M轉(zhuǎn)基因小鼠的F1代產(chǎn)仔數(shù)呈下降的趨勢(shì)(P＜0.05)，RNAi-M轉(zhuǎn)基因小鼠平均產(chǎn)仔為6.2±0.79只，野生型對(duì)照組平均產(chǎn)仔為9.8±0.16只;
　　(3)轉(zhuǎn)基因小鼠的發(fā)情的分析:RNAi-M轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)情期（29.44±0.38天）顯著地比野生型（27.11±0.49天）長(zhǎng)（P＜0.05）;
　　(4)轉(zhuǎn)基因小鼠的生殖激素的分析:對(duì)RNAi-M轉(zhuǎn)基因雌鼠血液中INHα和FSH的

4、濃度進(jìn)行了測(cè)定和分析，血清中INHα水平在3和6周齡呈現(xiàn)顯著下降(P＜0.05); FSH在3周顯著增加(P＜0.05)，而6周FSH濃度變化不顯著。
　　(5)轉(zhuǎn)基因小鼠的排卵數(shù)的探討:進(jìn)一步對(duì)RNAi-M轉(zhuǎn)基因小鼠排卵數(shù)進(jìn)，結(jié)果表明RNAi-M轉(zhuǎn)基因小鼠的排卵數(shù)也有所減少;
　　(6)轉(zhuǎn)基因小鼠的顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的分析:RNAi-M轉(zhuǎn)基因小鼠顯著地降低了卵巢顆粒細(xì)胞GCs的細(xì)胞周期G1期和S期細(xì)胞的數(shù)量（P＜0.05）;

5、
　　(7)轉(zhuǎn)基因小鼠的顆粒細(xì)胞凋亡的研究:與野生型對(duì)照組相比，RNAi-M轉(zhuǎn)基因小鼠顯著地提高了卵巢顆粒細(xì)胞GCs的凋亡水平(P＜0.05，由3.40％提高到9.70％);
　　(8)轉(zhuǎn)基因小鼠的顆粒細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的研究:RNAi-M轉(zhuǎn)基因小鼠抑制了卵巢顆粒細(xì)胞GCs的INHα的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，從而顯著促進(jìn)了細(xì)胞凋亡相關(guān)Caspase-3、BCL2、INHβ B和GDF9基因的表達(dá)、降低了kitl和TGFβ RⅢ基因的表

6、達(dá);
　　綜合上述試驗(yàn)結(jié)果:(1) INHα基因表達(dá)受到了強(qiáng)烈抑制(如本試驗(yàn)的64％)，從而改變了卵巢顆粒細(xì)胞中重要基因的正常表達(dá)，導(dǎo)致了卵巢顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、卵巢排卵、生殖激素分泌的紊亂，抑制了小鼠的發(fā)情和產(chǎn)仔數(shù)性能;(2) INHα基因雖然具有抑制FSH等重要激素分成分泌、負(fù)調(diào)控動(dòng)物繁殖性能，但在動(dòng)物體內(nèi)還是要維持一定的表達(dá)水平和發(fā)揮其重要作用，不能過度地抑制INHα基因的表達(dá)和功能;(3)還需要進(jìn)一步探討動(dòng)物體內(nèi)適宜的INH