擬南芥成膜素相關蛋白（PhrIP1）在植物細胞板形成中的功能研究.pdf

1、植物細胞有絲分裂后期由高爾基體衍生而來的泡囊沿著成膜體微管向赤道板移動，到達赤道板整齊排列，與成膜體微管共同形成桶狀成膜體。在赤道板上成膜素纏繞在泡囊外，將泡囊擠壓成啞鈴型(VTV)，同型VTV融合形成膜結構狀細胞板。細胞板的形成是一個連續(xù)的膜融合過程，隨著細胞板離心生長，膜融合發(fā)生在延伸細胞板的生長邊緣，到達母細胞壁并與母細胞壁融合形成新生細胞壁，將母細胞分裂成2個子細胞。細胞板形成與生長影響細胞的分裂，與植物細胞的周期循環(huán)、組織器官

2、發(fā)育、形態(tài)構建等息息相關。 植物動力蛋白-成膜素存在于成膜體中，在細胞板形成的早期泡囊融合中發(fā)揮重要作用。成膜素相關蛋白(PhrIP1)是從擬南芥cDNA文庫中分離出來的與成膜素相互作用的蛋白，在細胞分裂后期與成膜素共同定位于細胞板上。該蛋白結構中有1個富含賴氨酸的核定位結構域、2個RNA結合位點和3個鋅指結構，是一個新型的RNA結合蛋白。 推測PhrIP1的潛在功能：在植物細胞分裂前(間期)，PhrIP1 可能結合參與

3、細胞板形成的某種重要基因的mRNA，調節(jié)該基因的轉錄后的表達，為細胞后期分裂作準備；在細胞分裂后期，PhrIP1 可能結合該基因產(chǎn)物或其它蛋白，共同調節(jié)或促進成膜素起始復合物的形成，激發(fā)細胞板形成和延伸的早期泡囊融合。為探索PhrIP1 在細胞板形成中的作用，本文從以下5個方面對PhrIP1的潛在功能進行了研究。 1、利用酵母雙雜交技術研究與PhrIP1相互作用的靶蛋白用PhrIP1作誘餌，通過酵母雙雜交(LiAc-SS-DNA

4、-PEG酵母高效轉化)方法篩選擬南芥 AD-cDNA文庫，經(jīng)Leu營養(yǎng)缺陷型初篩獲得1925個克隆，X-Gal顯色復篩得到181個克隆，酵母菌落PCR檢測獲得90個克隆，抽提質粒經(jīng)酶切、PCR鑒定得到68個質粒，再經(jīng)回復驗證獲得60個陽性質粒，核苷酸測序結果分析，獲得46個與PhrIP1 相互作用的蛋白質的編碼基因。選擇其中4個基因進行克隆表達，純化其蛋白，經(jīng)體外蛋白質與蛋白質相互作用研究，證實4個靶蛋白均能與PhrIP1具有相互作用；

5、經(jīng)蛋白質結構分析和功能預測，確定33<'＃>基因編碼的小GTP結合蛋白Ran2作為研究的靶蛋白。 2、利用親和吸附法研究與PhrIP1相互作用的mRNA利用與GSTBeads結合的GST-PhrIP1 融合蛋白吸附擬南芥總RNA，提取結合的RNA，測定OD<,260>值，經(jīng)RT-PCR鑒定PhrIP1 特異結合的mRNA。將被特異結合基因克隆到pTYB2(含T7啟動子)載體上，在體外轉錄mRNA并用[α-<'32>P]rUTP標

6、記探針，經(jīng)紫外交聯(lián)、RNA凝膠電泳遷移試驗(REMSA)研究PhrIP1結合特異RNA的能力。結果表明PhrIP1能特異性結合Ran2-mRNA。 3、小GTP結合蛋白Ran2的GTPase活性、表達譜及亞細胞定位分析Ran2基因結構分析顯示，Ran2含有5個外顯子和4個內含子，其cDNA編碼約24 kD蛋白，該蛋白含有221氨基酸。在大腸桿菌中表達、純化Ran2蛋白，用鉬鐵鹽法測定其GTPase活性。結果表明Ran2具有固有的

7、GTP酶活性。RT-PCR和 Western blot分析結果表明，Ran2-mRNA在擬南芥根、莖、葉、花中均表達；Ran2蛋白存在存在植物可溶性部分中。熒光抗體定位結果表明，Ran2參與細胞有絲分裂的各個過程，在細胞有絲分裂間期，Ran2主要定位于核膜上，前期分散于細胞質中，后期定位于赤道板和紡錘體上，末期又回到子細胞核膜上。 4、不同植物Ran2基因的克隆及同源性分析從洋蔥、大蒜發(fā)芽根和油菜幼苗中抽提RNA，用擬南芥 Ra

8、n2引物和RT-PCR方法克隆Ran2基因，測序比對分析結果表明：擬南芥Ran2基因與洋蔥、大蒜和油菜Ran2的核苷酸序列同源性分別為99.70％、100％、89.94％；氨基酸序列同源性分別為99.10％、100％、96.38％(除了大蒜Ran2 C末端缺少一個天冬氨酸D外)。這些結果表明Ran2在植物進化中高度保守。 5、PhrIP1突變體分析及PhrIP1、Ran2基因超表達和RNAi載體的構建栽培擬南芥 PhrIP1 (

9、T-DNA)突變體與野生型，觀察其表型并進行分子生物學分析。結果顯示，PhrIP1 突變體與野生型在表型上沒有明顯差異。RT-PCR檢測PhrIP1-mRNA均為陽性。在植物可溶性蛋白中，利用PhrIP1 抗體進行 Western blot分析均未檢測到 PhrIP1。PhrIP1 是一種膜相關蛋白，與細胞的膜成分緊密結合不易被浸提出來。T-DNA插入的PhrIP1突變體仍可轉錄其mRNA，說明該突變體以非純合體存在(PhrIP1 為植