擬南芥成膜素相關(guān)蛋白（PhrIP1）在植物細(xì)胞板形成中的功能研究.pdf

1、植物細(xì)胞有絲分裂后期由高爾基體衍生而來的泡囊沿著成膜體微管向赤道板移動(dòng)，到達(dá)赤道板整齊排列，與成膜體微管共同形成桶狀成膜體。在赤道板上成膜素纏繞在泡囊外，將泡囊擠壓成啞鈴型(VTV)，同型VTV融合形成膜結(jié)構(gòu)狀細(xì)胞板。細(xì)胞板的形成是一個(gè)連續(xù)的膜融合過程，隨著細(xì)胞板離心生長，膜融合發(fā)生在延伸細(xì)胞板的生長邊緣，到達(dá)母細(xì)胞壁并與母細(xì)胞壁融合形成新生細(xì)胞壁，將母細(xì)胞分裂成2個(gè)子細(xì)胞。細(xì)胞板形成與生長影響細(xì)胞的分裂，與植物細(xì)胞的周期循環(huán)、組織器官

2、發(fā)育、形態(tài)構(gòu)建等息息相關(guān)。 植物動(dòng)力蛋白-成膜素存在于成膜體中，在細(xì)胞板形成的早期泡囊融合中發(fā)揮重要作用。成膜素相關(guān)蛋白(PhrIP1)是從擬南芥cDNA文庫中分離出來的與成膜素相互作用的蛋白，在細(xì)胞分裂后期與成膜素共同定位于細(xì)胞板上。該蛋白結(jié)構(gòu)中有1個(gè)富含賴氨酸的核定位結(jié)構(gòu)域、2個(gè)RNA結(jié)合位點(diǎn)和3個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，是一個(gè)新型的RNA結(jié)合蛋白。 推測PhrIP1的潛在功能：在植物細(xì)胞分裂前(間期)，PhrIP1 可能結(jié)合參與

3、細(xì)胞板形成的某種重要基因的mRNA，調(diào)節(jié)該基因的轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)，為細(xì)胞后期分裂作準(zhǔn)備；在細(xì)胞分裂后期，PhrIP1 可能結(jié)合該基因產(chǎn)物或其它蛋白，共同調(diào)節(jié)或促進(jìn)成膜素起始復(fù)合物的形成，激發(fā)細(xì)胞板形成和延伸的早期泡囊融合。為探索PhrIP1 在細(xì)胞板形成中的作用，本文從以下5個(gè)方面對(duì)PhrIP1的潛在功能進(jìn)行了研究。 1、利用酵母雙雜交技術(shù)研究與PhrIP1相互作用的靶蛋白用PhrIP1作誘餌，通過酵母雙雜交(LiAc-SS-DNA

4、-PEG酵母高效轉(zhuǎn)化)方法篩選擬南芥 AD-cDNA文庫，經(jīng)Leu營養(yǎng)缺陷型初篩獲得1925個(gè)克隆，X-Gal顯色復(fù)篩得到181個(gè)克隆，酵母菌落PCR檢測獲得90個(gè)克隆，抽提質(zhì)粒經(jīng)酶切、PCR鑒定得到68個(gè)質(zhì)粒，再經(jīng)回復(fù)驗(yàn)證獲得60個(gè)陽性質(zhì)粒，核苷酸測序結(jié)果分析，獲得46個(gè)與PhrIP1 相互作用的蛋白質(zhì)的編碼基因。選擇其中4個(gè)基因進(jìn)行克隆表達(dá)，純化其蛋白，經(jīng)體外蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用研究，證實(shí)4個(gè)靶蛋白均能與PhrIP1具有相互作用；

5、經(jīng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析和功能預(yù)測，確定33<'＃>基因編碼的小GTP結(jié)合蛋白R(shí)an2作為研究的靶蛋白。 2、利用親和吸附法研究與PhrIP1相互作用的mRNA利用與GSTBeads結(jié)合的GST-PhrIP1 融合蛋白吸附擬南芥總RNA，提取結(jié)合的RNA，測定OD<,260>值，經(jīng)RT-PCR鑒定PhrIP1 特異結(jié)合的mRNA。將被特異結(jié)合基因克隆到pTYB2(含T7啟動(dòng)子)載體上，在體外轉(zhuǎn)錄mRNA并用[α-<'32>P]rUTP標(biāo)

6、記探針，經(jīng)紫外交聯(lián)、RNA凝膠電泳遷移試驗(yàn)(REMSA)研究PhrIP1結(jié)合特異RNA的能力。結(jié)果表明PhrIP1能特異性結(jié)合Ran2-mRNA。 3、小GTP結(jié)合蛋白R(shí)an2的GTPase活性、表達(dá)譜及亞細(xì)胞定位分析Ran2基因結(jié)構(gòu)分析顯示，Ran2含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，其cDNA編碼約24 kD蛋白，該蛋白含有221氨基酸。在大腸桿菌中表達(dá)、純化Ran2蛋白，用鉬鐵鹽法測定其GTPase活性。結(jié)果表明Ran2具有固有的

7、GTP酶活性。RT-PCR和 Western blot分析結(jié)果表明，Ran2-mRNA在擬南芥根、莖、葉、花中均表達(dá)；Ran2蛋白存在存在植物可溶性部分中。熒光抗體定位結(jié)果表明，Ran2參與細(xì)胞有絲分裂的各個(gè)過程，在細(xì)胞有絲分裂間期，Ran2主要定位于核膜上，前期分散于細(xì)胞質(zhì)中，后期定位于赤道板和紡錘體上，末期又回到子細(xì)胞核膜上。 4、不同植物Ran2基因的克隆及同源性分析從洋蔥、大蒜發(fā)芽根和油菜幼苗中抽提RNA，用擬南芥 Ra

8、n2引物和RT-PCR方法克隆Ran2基因，測序比對(duì)分析結(jié)果表明：擬南芥Ran2基因與洋蔥、大蒜和油菜Ran2的核苷酸序列同源性分別為99.70％、100％、89.94％；氨基酸序列同源性分別為99.10％、100％、96.38％(除了大蒜Ran2 C末端缺少一個(gè)天冬氨酸D外)。這些結(jié)果表明Ran2在植物進(jìn)化中高度保守。 5、PhrIP1突變體分析及PhrIP1、Ran2基因超表達(dá)和RNAi載體的構(gòu)建栽培擬南芥 PhrIP1 (

9、T-DNA)突變體與野生型，觀察其表型并進(jìn)行分子生物學(xué)分析。結(jié)果顯示，PhrIP1 突變體與野生型在表型上沒有明顯差異。RT-PCR檢測PhrIP1-mRNA均為陽性。在植物可溶性蛋白中，利用PhrIP1 抗體進(jìn)行 Western blot分析均未檢測到 PhrIP1。PhrIP1 是一種膜相關(guān)蛋白，與細(xì)胞的膜成分緊密結(jié)合不易被浸提出來。T-DNA插入的PhrIP1突變體仍可轉(zhuǎn)錄其mRNA，說明該突變體以非純合體存在(PhrIP1 為植