馬立克氏病病毒感染與促炎癥反應(yīng)發(fā)生及其機(jī)理的研究.pdf

1、馬立克氏病病毒(Marek's disease virus，MDV)依據(jù)基因組結(jié)構(gòu)分類屬于皰疹病毒科，α皰疹病毒亞科。MDV分為三種血清型：致瘤性血清Ⅰ型(MDV-1)、非致瘤性血清Ⅱ型(MDV-2)和非致病性血清Ⅲ型(MDV-3)或稱火雞皰疹病毒(herpesvirus of turkeys，HVT)。MDV-1是禽類馬立克氏病(Marek's disease，MD)的病原體，其毒力由低至高依次為溫和型(m)、毒力型(v)、超強(qiáng)毒力型

2、(vv)和特超強(qiáng)毒力型(vv+)。MD是致死性的淋巴系統(tǒng)增生性疾病并伴隨神經(jīng)系統(tǒng)病變。神經(jīng)系統(tǒng)病變以早期短暫麻痹(TP)、持續(xù)性神經(jīng)損傷和晚期麻痹等為特征。MDV感染后可引起強(qiáng)烈的細(xì)胞因子反應(yīng)。細(xì)胞因子應(yīng)答在介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)以及對(duì)抗病毒感染過程中起重要作用。MDV可感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)并引起不同類型的病理反應(yīng)。MDV感染后的細(xì)胞因子反應(yīng)在腦組織局部天然免疫反應(yīng)和免疫病理反應(yīng)過程中均發(fā)揮重要作用。本次實(shí)驗(yàn)首先以雞大腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞為

3、研究對(duì)象，研究并評(píng)價(jià)小膠質(zhì)細(xì)胞在vvMDV毒株YL040920和弱毒疫苗株CVI988/Rispens體外感染后的促炎癥反應(yīng)效應(yīng)。Toll樣受體家族(toll-likereceptors，TLRs)識(shí)別病毒是誘導(dǎo)促炎癥反應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，很多病毒和病毒配體可活化TLR2信號(hào)并伴隨促炎癥反應(yīng)發(fā)生。但對(duì)于雞TLRs在MDV誘導(dǎo)促炎癥反應(yīng)發(fā)生中的作用還不明確。TLR15屬于TLR1家族成員并具有禽類特異性。然而，對(duì)于TLR15與病毒

4、感染的關(guān)系還無(wú)研究。因此，本次實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究TLR2和TLR15信號(hào)在MDV感染后促炎癥反應(yīng)發(fā)生中的作用。研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　 1、雛雞大腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及小膠質(zhì)細(xì)胞純化鑒定。從雛雞大腦皮質(zhì)得到混合神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物。然后通過“振蕩-吸附”分離和“吸附-富集”等程序純化得到小膠質(zhì)細(xì)胞。通過細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)表達(dá)非特異性酯酶的小膠質(zhì)細(xì)胞并確定細(xì)胞的純度。通過雙重的“分離-富集”程序，可得到純化的小膠質(zhì)細(xì)胞單層培養(yǎng)物，其純度

5、>95%。
　　 2、vvMDV毒株YL040920和弱毒疫苗株CVI988/Rispens病毒體外感染小膠質(zhì)細(xì)胞。純化的小膠質(zhì)細(xì)胞單層分別感染YL040920和CVI988/Rispens病毒。YL040920和CVI988/Rispens活病毒在體外感染小膠質(zhì)細(xì)胞3d后逐漸產(chǎn)生以多處細(xì)胞脫落為特征的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。使用MDV MEQ的特異性mAb，通過免疫組織化學(xué)法檢測(cè)到病毒感染3d后小膠質(zhì)細(xì)胞核內(nèi)MEQ蛋白的表達(dá)。

6、通過檢測(cè)MDV meq基因DNA的復(fù)制和gB基因mRNA的轉(zhuǎn)錄，證明了病毒DNA和特定基因可在小膠質(zhì)細(xì)胞復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。YL040920和CVI988/Rispens病毒感染后meq DNA和gB mRNA均可在小膠質(zhì)細(xì)胞復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，但CVI988/Rispens感染的小膠質(zhì)細(xì)胞的病毒載量和gB mRNA轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于相同數(shù)量的YL040920感染的小膠質(zhì)細(xì)胞(P≤0.05/0.01/0.001)。
　　 3、MDV-1可感染雞

7、大腦小膠質(zhì)細(xì)胞并促進(jìn)其Toll樣受體15和1LB基因的轉(zhuǎn)錄。分別用YL040920和CVI988/Rispens感染純化的小膠質(zhì)細(xì)胞用qRT-PCR法檢測(cè)MDV-1感染對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞Toll樣受體家族基因轉(zhuǎn)錄的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MDV-1的感染可上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞TLR15和TLR1LB基因的轉(zhuǎn)錄水平。小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR15和TLR1LB mRNA的轉(zhuǎn)錄水平在YL040920感染1d后升高，于3 dpi達(dá)到最高值，到5 dpi時(shí)有所降低。檢測(cè)到

8、小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR1LB mRNA轉(zhuǎn)錄水平在CVI988/Rispens感染1d后升高，到3 dpi時(shí)達(dá)最高值，而TLR15 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平在3 dpi后開始升高，二者在5 dpi時(shí)均降低。比較YL040920和CVI988/Rispens對(duì)TLRs mRNA轉(zhuǎn)錄的影響發(fā)現(xiàn)vvMDV毒株YL040920感染小膠質(zhì)細(xì)胞后主要促進(jìn)其TLR15基因的轉(zhuǎn)錄(P≤0.01/0.001)，而弱毒疫苗株CVI988/Rispens感染后則主要促進(jìn)

9、TLRILB基因的轉(zhuǎn)錄(P≤0.001)。
　　 4、MDV-1感染雛雞小膠質(zhì)細(xì)胞后細(xì)胞因子和iNOS的表達(dá)模式。用YL040920或CVI988毒株的活病毒感染純化的雛雞小膠質(zhì)細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管YL040920感染小膠質(zhì)細(xì)胞后病毒載量低于CVI988感染后的病毒載量，但二者促進(jìn)IFN-γ和IL-12p35 mRNA轉(zhuǎn)錄水平增加的程度無(wú)顯著性差異(P>0.05)。與CVI988相比，YL040920活病毒或固定病毒刺激小膠質(zhì)細(xì)

10、胞后IL-12p40、IL-8和MIP-1β基因的轉(zhuǎn)錄顯著增加(P≤0.01/0.001)。CVI988(尤其是活病毒)可顯著促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞IFN-β mRNA轉(zhuǎn)錄，而YL040920促進(jìn)IFN-β mRNA轉(zhuǎn)錄的作用較弱(P≤0.05/0.001)。iNOS基因的轉(zhuǎn)錄和NO表達(dá)均與YL040920和CVI988感染的水平有關(guān)。固定的MDV(尤其是CVI988毒株)具有更強(qiáng)的促進(jìn)iNOS/NO表達(dá)的活性(P≤0.05/0.01/0.00

11、1)。研究認(rèn)為，小膠質(zhì)細(xì)胞是MDV感染后IL-12p40、IL-12p35、IFN-γ、IFN-β、IL-8、MIP-1β、iNOS mRNA和NO等的重要來源。IL-12p35和IFN-γ基因的轉(zhuǎn)錄與病毒DNA的復(fù)制密切相關(guān)；而IL-12p40、IFN-β、IL-8和MIP-1β的轉(zhuǎn)錄水平與病毒DNA的復(fù)制和病毒特定基因的表達(dá)均相關(guān)。iNOS mRNA的轉(zhuǎn)錄依賴于病毒特定基因的表達(dá)，但受病毒復(fù)制的抑制。盡管YL040920和CVI98

12、8感染小膠質(zhì)細(xì)胞后Th1類細(xì)胞因子IFN-γ轉(zhuǎn)錄增加的程度并無(wú)差異，但YL040920誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的IL-12(p40和12p35)、IL-8和MIP-1β反應(yīng)。
　　 5、HVT感染抑制TLR1/2復(fù)合體介導(dǎo)的NF-κB活化。用HVT FC-126毒株感染Vero細(xì)胞單層。HVT感染后的Vero細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮，隨后病變細(xì)胞簇迅速發(fā)展為呈針狀放射排列。用qPCR檢測(cè)到病毒感染后Vero細(xì)胞內(nèi)HVT SORF1基因的復(fù)制。將pV

13、ITRO1-chTLR1LA(1-1)、chTLR1LB(1-2)、chTLR2A(2-1)、chTLR2B(2-2)重組表達(dá)質(zhì)粒和pNiFty2-SEAP用LipofectamineTM2000(Invitrogen)共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，使其在Vero細(xì)胞表達(dá)。HVT感染可以顯著抑制單獨(dú)或共轉(zhuǎn)染了chTLR1-1和chTLR1-2的Vero細(xì)胞內(nèi)NF-κB的基礎(chǔ)活性(P≤0.01/0.001)。Zymosan可顯著促進(jìn)chTLR1和c

14、hTLR2共轉(zhuǎn)染的Vero細(xì)胞內(nèi)的NF-κB活性，HVT感染后還可以顯著抑制由Zymosan誘導(dǎo)的NF-κB活化(P≤0.05/0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，chTLR1s(1LA或1LB)參與HVT感染后TLR1/2信號(hào)途徑的抑制環(huán)節(jié)。
　　 6、MDV-1感染后通過TLR1/2復(fù)合體和TLR15活化NF-κB。實(shí)驗(yàn)通過RNAi的方式分別抑制TLR1LA、TLR1LB、TLR2A、TLR2B和TLR15在DF-1細(xì)胞的表達(dá)。結(jié)果發(fā)

15、現(xiàn)，TLR1/2復(fù)合體和TLR15在MDV-1感染后NF-κB活化過程中均起作用(P≤0.01/0.001)，但前者的作用明顯強(qiáng)于后者(P≤0.01/0.001)。在TLR1/2復(fù)合體中，TLR2B起相對(duì)重要的作用(P≤0.05)，而TLR1LA和TLR1LB之間未發(fā)現(xiàn)作用的差異(P>0.05)。與感染弱毒疫苗株CVI988病毒相比，TLR15在vvMDV毒株YL040920感染后NF-κB活化過程中的作用相對(duì)明顯(P<0.05)。

16、r>　　 概括而言，本課題研究發(fā)現(xiàn)MDV-1(包括vvMDV和弱毒疫苗株CVI988)均可感染雞大腦小膠質(zhì)細(xì)，并分別促進(jìn)TLR15和TLR1LB基因轉(zhuǎn)錄。vvMDV感染小膠質(zhì)細(xì)胞后可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的IL-12、IL-8和MIP-1β等促炎癥反應(yīng)，它們可能誘導(dǎo)MDV感染后腦組織局部Th1反應(yīng)。MDV-1感染后主要通過與TLR1/2復(fù)合體相互作用，活化NF-κB，誘導(dǎo)促炎癥反應(yīng)。TLR15在MDV-1(尤其是vvMDV)感染后促炎癥反應(yīng)信號(hào)活化