年齡相關性黃斑變性轉錄組表達特征及臨床治療研究.pdf

1、本文分為以下幾個部分進行探討：
　　第一部分 年齡相關性黃斑變性患者與健康人基因表達譜差異分析
　　目的:
　　通過對年齡相關性黃斑變性患者與健康人基因表達譜的差異性分析，得出可能與AMD發(fā)病相關的基因，并進行功能學分析。
　　方法:
　　基于NCBI GEO數據庫中已發(fā)表的基因表達譜芯片數據進行整合分析，原始芯片數據來源GEO數據庫收錄的GSE76237與GSE29801表達譜芯片數據。其中GSE7623

2、7包含14例年齡相關性黃斑變性病人與15例健康正常人的單核細胞，采用Affymetrix Gene1.0 ST芯片進行表達譜分析;GSE29801包含177例年齡相關性黃斑變性患者捐贈者視網膜-脈絡膜組織樣本與118例沒有眼部疾病的捐贈者的視網膜-脈絡膜組織樣本，采用Agilent-014850 Whole Human GenomeMicroarray4x44K G4112F表達譜芯片進行檢測。本次分析分別從全血單核細胞表達譜芯片與病變

3、組織樣本表達譜芯片兩個角度進行數據整合分析，數據分析方法包括:1、芯片數據歸一化分析:Bioconductor limma package;2、差異基因分析:Bioconductor limma package;3、GO與KEGG功能富集分析:WEB-basedGene Set Analysis Toolkit;4、繪圖:R語言，得出差異性表達基因(Differentiallyexpressed genes，DEGs)，并進行這些差異性

4、表達基因的功能學分析。
　　結果:
　　1.通過對AMD患者與健康正常人全血單核細胞表達譜芯片進行生物信息學分析，按照差異倍數大于1.5以及矯正后的p值小于0.05進行差異性基因篩選，總共獲得111個差異性表達基因，上調表達基因28個，下調表達基因83個。其中差異倍數大于2倍的差異性表達基因8個，上調表達2個，下調表達6個。
　　2.AMD患者外周血單個核細胞差異表達基因基因本體學(Gene ontology，GO)功

5、能富集分析結果顯示，差異性表達基因參與的主要生物學功能包括白細胞活化、淋巴細胞活化、T細胞活化以及T細胞募集等。
　　3.AMD患者外周血單個核細胞差異性表達基因KEGG(Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes)富集分析結果顯示，差異性表達的基因主要參與造血細胞、T細胞受體通路、Th1 and Th2細胞分化、Th17細胞分化以及原發(fā)性免疫缺陷等信號通路。
　　結論:
　　1.AM

6、D患者和對照組之間外周血單個核細胞的基因表達譜具有顯著差異，提示組織病變可能誘發(fā)機體的免疫反應，從而引起單個核細胞表達圖譜的變化。但其變化呈現出漸進的趨勢，提示衰老可能是參與AMD疾病發(fā)生發(fā)展的因素之一。
　　2.AMD患者外周血單個核細胞差異性表達基因參與的主要生物學功能包括白細胞的活化、淋巴細胞的活化、T細胞的活化以及募集等，其主要參與的信號通路包括造血細胞、T細胞受體通路、Th1 and Th2細胞分化、Th17細胞分化以及

7、原發(fā)性免疫缺陷等，這些均提示差異性表達基因可能與AMD患者的免疫反應密切相關。
　　3.AMD患者其外周血單個核細胞基因表達譜特征的變化和組織基因表達譜特征的變化并不相同，這可能與AMD的發(fā)病激發(fā)了全身免疫系統(tǒng)，在單核細胞與病變組織上均有累及，但出現了不同的基因表達有關。
　　第二部分 年齡相關性黃斑變性轉錄組研究
　　目的:
　　通過AMD患者與健康人轉錄組研究，發(fā)掘差異性表達基因對AMD發(fā)病和預后的影響機制，

8、為尋找新的診治靶點提供實驗依據，為AMD診斷指標及預后指標的研究奠定實驗基礎。
　　方法:
　　根據本研究第一部分的結果，我們首先從應用生物信息學方法對GEO數據庫來源的AMD外周血單個核細胞樣本基因表達譜數據進行生信分析得出的差異性表達基因(DEGs)中篩選出8個差異性表達基因(包括TMEM176A、TMEM176B、ZEB2、LEF1、FCMR、MS4A1、CD3G和IL7R)。然后通過實時熒光定量PCR技術(Real-

9、time qPCR)，在包含有21例中國AMD患者外周血單個核細胞(PBMC)的實驗組與15例中國健康人外周血單個核細胞(PBMC)的對照組樣本中，對這些DEGs進行驗證，得出差異性表達基因在中國AMD患者PBMC中的表達是否有差異，并進一步將實驗組按照年齡、性別、治療效果不同進行分組，分別進行實驗驗證及對比研究。
　　結果:
　　1.在這8個候選差異性表達基因中，共3個基因在驗證樣本中結果與數據挖掘結果相一致，TMEM17

10、6A、TMEM176B和ZEB2在AMD外周血單個核細胞(PBMCs)中顯著上調表達（P=0.0000，0.0000，0.0000，P＜0.001）;另外5個候選DEGs在驗證樣本中的結果與數據挖掘結果并不一致，LEF1、MS4A1、CD3G、FCMR與IL7R在AMD患者PBMCs中表達顯著上調(P=0.0000，0.0000，0.0000,0.0000,0.0000, P＜0.001)。
　　2.8個候選基因在AMD組不同性別

11、病人PBMCs中的表達水平與健康正常人不同性別中的表達水平相比均存在顯著差異，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01); TMEM176A、FCMR、CD3G、MS4A1、IL7R、ZEB2與LEF1基因表達水平在女性患者中高于男性患者，但兩者之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05); TMEM176B基因在男性患者中高于女性患者，兩者之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。這表明，與健康人相比較，8個候選基因表達水平在不同性別的患者外周

12、血PBMCs中均存在顯著差異，但與患者的性別無顯著相關。
　　結論:
　　1.TMEM176A、TMEM176B、ZEB2、LEF1、FCMR、MS4A1、CD3G和IL7R在AMD患者外周血單個核細胞中存在顯著差異性表達。這些差異表達基因其功能主要涉及膜受體及相關的信號傳導，其編碼的蛋白主要分布在細胞膜外側，其參與的生物學過程主要涉及免疫反應及免疫細胞的分化。這些均提示AMD的發(fā)生發(fā)展與全身免疫反應密切相關。
　　2

13、.候選基因表達水平在不同性別的患者外周血PBMCs中與健康人比較均存在顯著差異，但與患者的性別無顯著相關。提示AMD的發(fā)生進展無明顯性別差異。
　　第三部分 抗VEGF藥物玻璃體腔注射聯合PDT治療年齡相關性黃斑變性的療效研究
　　目的:
　　尋找更加安全有效的AMD治療方案，為新的AMD治療方案的制定提供理論依據。
　　方法:
　　按照入選標準及排除標準選擇2013年1月-2016年1月期間在鄭州大學第一

14、附屬醫(yī)院被診斷為年齡相關性黃斑變性的96例（192只眼睛）患者。按照治療方案，患者被隨機分成觀察組和對照組，每組48例（96只眼睛）。對照組患者進行抗VEGF藥物治療，玻璃體腔注射0.5 mg/0.05 ml雷珠單抗，根據3+prn治療方案，每月注射一次，連續(xù)注射3次后根據病情需要再追加注射。觀察組患者進行抗VEGF藥物聯合PDT治療方法，PDT治療按照年齡相關性黃斑變性的多中心PDT治療研究(Treatment of age-rela

15、ted macular degeneration withphotodynamic therapy，TAP)的方法進行，維替泊芬用量為TAP方法計算量6mg/m2，激波長689nm，光輻照度600 mw/ cm2，能量50 J/cm2，照射時間83 S。在PDT治療后3天內行玻璃體腔注射0.5 mg/0.05 ml雷珠單抗。治療前和治療后1周-6月分別檢測最佳矯正視力、眼部血流動力學改變、黃斑中心凹厚度(CFT)及視野參數。采用SPSS

16、23.0統(tǒng)計軟件分析本研究的數據。
　　結果:
　　1.治療后兩組患者最佳矯正視力均緩慢上升。術后1周-6個月內，觀察組患者最佳矯正視力明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);觀察組患者視力提高的比例高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2.治療后6個月內彩色多普勒超聲檢查顯示，觀察組患者睫狀后短動脈(PCA)的最大收縮期血流速度(PSV)和舒張末期血流速度(EDV)值高于對照組，差異有統(tǒng)計

17、學意義(P＜0.05);觀察組患者動脈阻力指數(RI)和脈動指數(PI)值低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論:
　　1.抗VEGF藥物聯合PDT療法能夠明顯提高治療后最佳矯正視力，治療后提高視力的比率明顯增高，治療AMD效果明顯。
　　2.抗VEGF藥物聯合PDT療法能夠改善PCA血流動力學參數，血液供應改善能減輕黃斑中心的水腫，降低中心凹厚度(CFT)值，減少視野缺損，具有較高的臨床應用價值。<