Delphinidin預防年齡相關性黃斑變性體外實驗研究.pdf

1、年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration，ARMD）是一種老年常見病，流行病學調查發(fā)現(xiàn)其發(fā)病率越來越高，因ARMD致盲的人數(shù)將會超過因青光眼和糖尿病性視網(wǎng)膜病變的致盲數(shù)，成為一個社會性的公共問題。然而，現(xiàn)在臨床上對已經(jīng)發(fā)生損傷的ARMD患者治療效果并不明顯，TAP（Treatment of Age-Related Macular Degeneration with Photodynamic T

2、herapy）和VIP（visual impairment project）研究發(fā)現(xiàn)，在重度ARMD臨床治療組同未治療組相比較分別僅僅有5％、8％的病人通過治療視網(wǎng)膜下新生血管而獲得視力提高?，F(xiàn)在已經(jīng)認識到對其研究的重點應放在預防ARMD的發(fā)生和發(fā)展上，包括預防干性ARMD中視網(wǎng)膜色素上皮細胞（retinal pigment epithelium，RPE）的氧化損傷和濕性ARMD中新生血管的生成，而不是單純治療各種已發(fā)生的損傷。

3、 近年來，自然藥物在人類疾病的預防和治療中應用越來越廣，其中1983-1994年研究的520種藥物中，39％是來自自然產(chǎn)品，1999年銷售量最大的20種非蛋白類藥物中，9種是由自然產(chǎn)品發(fā)展而來。在ARMD的防治上已經(jīng)有些藥物正嶄露頭角，如博視康牌葉黃素片等，但其昂貴的價格和其主要的抗氧化損傷作用，使其在應用上有一定的局限性[4]。而delphinidin為花色素的一種主要成份，大量存在于蔬菜和水果中，已經(jīng)研究其有強的抗氧化、抗新生血管生

4、成、抗腫瘤生長的能力[5]，其是否對RPE細胞的氧化損傷和脈絡膜血管內(nèi)皮細胞新生血管生成功能具有抑制作用目前不清楚。我們假定delphinidin對RPE細胞和內(nèi)皮細胞的作用同對其他細胞一樣，既可以抗氧化損傷，又可以抑制新生血管生成，則對其的研究有望為ARMD的防治帶來新的曙光。 目的： 1、探討delphinidin對ARPE-19細胞氧化損傷的保護作用及其機制。 2、研究delphinidin對缺氧環(huán)境下AR

5、PE-19細胞和猴脈絡膜視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮（hesus choroids-retina endothelial cell line，RF/6A）細胞VEGF表達的影響及可能機制。 3、觀察delphinidin抗RF/6A細胞體外新生血管生成的作用及機制。 方法： 1、利用MTT比色法，觀察體外培養(yǎng)條件下，delphinidin對ARPE-19細胞增殖活性的影響；Hoechst染色、JC-1、ROS試劑盒和RT-PC

6、R分別檢測細胞在H2O2氧化損傷下不同濃度delphinidin（1μM、5μM、10μM、20μM）預處理組同對照組中細胞凋亡、線粒體胞膜電位、ROS含量和bcl-2 mRNA含量的變化。 2、傳代培養(yǎng)ARPE-19、RF/6A細胞，Ⅷ因子免疫組化鑒定RF/6A細胞；MTT檢測delphinidin對RF/6A細胞毒性；delphinidin（1μM、5μM、10μM、20μM）預處理組和對照組采用western-blot法檢

7、測各組細胞在CoCl2損傷下對VEGF、HIF-1α、HIF-2α蛋白表達的變化。 3、傳代培養(yǎng)RF/6A細胞，實驗分為對照組及delphinidin（1μM、5μM、10μM、20μM）預處理組，采用MTT和caspase-3免疫組化法檢測各組在VEGF刺激下RF/6A細胞增殖和凋亡情況；transwell小室遷移和Matrigel膠體外血管形成實驗觀察細胞遷移及血管形成情況；western-blot檢測各組VEGF刺激下P-

8、FAK蛋白表達變化。 結果： 1.10-6M～10-1M delphinidin處理ARPE-19細胞后未發(fā)現(xiàn)有細胞毒性。用1μM、5μM、10μM、20μM delphinidin分別預處理RPE細胞后進行H2O2氧化損傷，發(fā)現(xiàn)凋亡細胞的數(shù)量減少，線粒體膜電位的降低程度減少，細胞內(nèi)ROS含量減少，bcl-2 mRNA含量增加，且這些變化具有劑量依賴性，各處理組與對照組相比差異有顯著性，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.

9、05）。 2.Ⅷ因子胞漿著染證明所用RF/6A細胞為內(nèi)皮細胞，10-6M～10-1M delphinidin并未顯示出對RF/6A細胞毒性。1μM、5μM、10μM、20μM delphinidin預處理RPE、RF/6A細胞組可見CoCl2損傷后的VEGF、HIF-1α蛋白表達較對照組明顯減少，且呈劑量相關性，各處理組與對照組相比差異有顯著性，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。而HIF-2α蛋白的表達并未受到影響，各處

10、理組同對照組相比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。 3.1μM、5μM、10μM、20μM delphinidin預處理RF/6A細胞組可呈劑量依賴性抑制VEGF刺激下細胞的體外增殖、遷移和體外血管形成，同時P-FAK蛋白表達降低，各處理組與對照組相比差異有顯著性，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 結論： 1.Delphinidin可減輕H2O2造成的ARPE-19細胞氧化損傷，其機制可能是通過改善