解除獨行菜種子低溫萌發(fā)停滯的溫度響應蛋白篩選及表達分析.pdf

1、獨行菜(Lepidium apetalum Willd.)為十字花科獨行菜屬植物，分布十分廣泛。前期研究發(fā)現(xiàn)，生活在新疆北部的獨行菜在低溫下萌發(fā)到一定階段會出現(xiàn)停滯現(xiàn)象，而經(jīng)較高溫度短時間處理，種子即可在低溫下繼續(xù)萌發(fā)生長。因此運用蛋白質組學技術，從解除低溫萌發(fā)停滯的獨行菜種子中篩選相關響應蛋白，并分析各蛋白相應基因在低溫萌發(fā)不同時期的表達情況，克隆解除低溫萌發(fā)停滯的關鍵基因，為闡明新疆北部獨行菜早春低溫萌發(fā)的調控機制和獨行菜廣泛分布的

2、區(qū)系特征提供理論依據(jù)。主要研究結果如下：
　　1.獨行菜種子蛋白雙向電泳體系的建立
　　比較了三種常用植物蛋白提取方法對獨行菜種子蛋白的提取效果，最終采用TCA/丙酮沉淀法進行提取；優(yōu)化組合上樣方式，聚焦程序，分離膠濃度等蛋白分離條件，最終建立了一套適用于獨行菜種子蛋白質的雙向電泳體系，得到2-DE圖譜重復性好，分辨率高。
　　2.低溫萌發(fā)停滯解除前后差異表達蛋白的圖譜分析
　　比較低溫萌發(fā)停滯解除前后的2-DE

3、圖譜，篩選得到37個差異蛋白點，對其中6個低溫萌發(fā)停滯解除后表達量顯著上調的蛋白點做LC-MS/MS質譜鑒定。根據(jù)鑒定結果，將這六個蛋白按功能分為三大類：第一類為分子伴侶，包括Cpn60，Hsp17.6I，Hsp70；第二類為過氧化物酶，包括Per12和Per28；第三類為細胞分裂控制蛋白即Cdc48E。
　　3.關鍵蛋白的相應基因表達分析
　　以上述鑒定結果檢索獨行菜種子轉錄組數(shù)據(jù)庫，得到關鍵蛋白相應基因的部分核酸序列信息

4、。從轉錄水平對Per12，Hsp17.6I和Cdc48E三種蛋白的表達進行分析，對它們相應的基因PER12，HSP17.6和CDC48E在獨行菜種子低溫萌發(fā)停滯解除前后及在經(jīng)25℃處理不同時間低溫萌發(fā)停滯期的種子中的表達情況進行分析，發(fā)現(xiàn)三個基因的表達量在25℃處理萌發(fā)停滯期的種子30min后較未解除停滯前均顯著增加，且25℃處理45-55min內，表達量隨25℃處理時間的增加而增加，處理60min后，表達趨于穩(wěn)定，不再顯著增長。

5、>　　4.獨行菜種子CDC48E基因的克隆與序列分析
　　采用同源克隆技術，獲得了獨行菜種子CDC48E的保守區(qū)片段。該基因保守區(qū)cDNA含有1103bp，約編碼363個氨基酸。運用生物信息學軟件對解除低溫萌發(fā)停滯的獨行菜種子的CDC48E基因的保守區(qū)核酸序列進行分析和預測， 結果表明：該核酸片段含有兩個AAA保守結構域，分別位于163-567，166-576bp處；還含有一個CDC48結構域，位于753-1007bp處