卡維地洛抗血管形成及抑制肝纖維化的分子機(jī)制研究.pdf

1、纖維化是指由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，導(dǎo)致肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過(guò)度沉淀的病理過(guò)程。我國(guó)每年有許多慢性肝炎患者最終發(fā)展為肝硬化。深入研究肝纖維化的發(fā)生機(jī)制，控制及逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進(jìn)程具有重要的意義。目前普遍認(rèn)為肝星狀細(xì)胞(HSC)的激活是肝纖維化形成初始的中心環(huán)節(jié)，并發(fā)現(xiàn)肝纖維化是可逆轉(zhuǎn)的。HSC的激活包括兩個(gè)步驟，即初始激活及持續(xù)激活。前者主要由旁分泌機(jī)制參與，而后者則既有旁分泌機(jī)制參與又有自分泌機(jī)制參與。HSC的激

2、活與多種細(xì)胞因子密切相關(guān)，其中血小板衍生因子(PDGF)及其信號(hào)系統(tǒng)具有極強(qiáng)的刺激HSC活化與有絲分裂作用，PDGF及其信號(hào)系統(tǒng)也是抗肝纖維化治療靶點(diǎn)之一。
　　血管生成是指機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中或創(chuàng)傷修復(fù)、缺血缺氧或炎癥等情況下，原有微血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)生芽、遷移、增殖與基質(zhì)重塑等形成新毛細(xì)血管的過(guò)程。在肝纖維化進(jìn)程中，除肝內(nèi)炎癥和ECM沉積外，還存在著血管增生及血管結(jié)構(gòu)的重建，其中肝竇的毛細(xì)血管化會(huì)使其失去大量通透性極好的篩狀排列的

3、窗孔結(jié)構(gòu)，影響肝細(xì)胞與血液之間進(jìn)行活躍的物質(zhì)交換，加重肝細(xì)胞供能及供氧障礙，促進(jìn)肝臟纖維化發(fā)展。近年來(lái)國(guó)外多項(xiàng)研究表明肝纖維化與肝臟血管生成有一定相關(guān)性。有報(bào)道抗血管生成治療可改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝纖維化;目前亦普遍認(rèn)為肝臟的血管新生與纖維化的形成是相互需求、相互促進(jìn)的。肝星狀細(xì)胞與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用也一直是肝纖維化研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。
　　外泌體(exosome)是一類由多囊泡體或細(xì)胞膜產(chǎn)生的一類細(xì)胞外膜性小泡，其首要生物學(xué)功能是

4、進(jìn)行細(xì)胞間聯(lián)絡(luò)。外泌體含有細(xì)胞特異性蛋白分子、mRNA及miRNAs等重要分子，通過(guò)將這些分子送達(dá)靶細(xì)胞而發(fā)揮細(xì)胞間聯(lián)絡(luò)作用。近年來(lái)有研究探索了外泌體在肝臟炎癥、纖維化和門脈高壓發(fā)病機(jī)理中的潛在作用。亦有假設(shè)提出肝硬化患者中外泌體產(chǎn)生有增高。然而外泌體是如何在靶細(xì)胞發(fā)揮作用的機(jī)制未明，特別是在內(nèi)皮細(xì)胞如何調(diào)控HSC遷移中的作用值得研究。
　　卡維地洛是第三代非選擇性β受體阻滯劑，兼有α1受體阻滯、抗氧化以及鈣通道拮抗活性。有報(bào)道提

5、示卡維地洛可減輕酒精或CCl4誘導(dǎo)的鼠肝纖維化，但其作用機(jī)制未見(jiàn)詳細(xì)闡述。亦有報(bào)道提示其類似物普萘洛爾具有抗血管形成作用?？傊ňS地洛可能具有抗肝纖維化及血管形成的作用，但缺乏研究及證據(jù)。
　　本研究首先觀察卡維地洛對(duì)肝星狀細(xì)胞(HSC)激活是否有直接抑制作用，接著研究了卡維地洛對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的功能影響。最后，我們研究了源于內(nèi)皮細(xì)胞的外泌體對(duì)HSC的激活作用及其機(jī)制?？傊覀冄芯苛藘?nèi)皮細(xì)胞與HSC相互作用促肝纖維化機(jī)制及藥物治療的

6、意義。
　　第一部分卡維地洛通過(guò)PDGFR/AKT通路抑制人肝星狀細(xì)胞的增殖及活化
　　目的：
　　以人肝星狀細(xì)胞系(LX-2)為研究對(duì)象，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究卡維地洛對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)的HSC激活的影響，并進(jìn)一步探討其內(nèi)在機(jī)制。
　　方法：
　　1.CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖水平
　　按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的分組（空白對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照以及藥物處理）情況，將細(xì)胞分入96-孔培養(yǎng)板培養(yǎng)。24h后進(jìn)行CCK8分析，檢測(cè)卡維地洛

7、對(duì)HSCs增殖的影響。
　　2.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力
　　按實(shí)驗(yàn)分組將細(xì)胞接種于6孔板中，200μL滅菌移液器槍頭沿培養(yǎng)板劃直線，加入PDGF-BB及濃度梯度的卡維地洛處理24h后圖像采集。
　　3.使用Transwell進(jìn)行侵襲能力測(cè)試
　　按實(shí)驗(yàn)分組將細(xì)胞接種于鋪有基質(zhì)膠的Transwell小室上室，同時(shí)加入不同濃度的卡維地洛，下室加入PDGF-BB。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后取出上室，剪下底部膜染色，光學(xué)顯微鏡

8、下圖像采集并計(jì)數(shù)。
　　4.Real-time PCR和Western Blot檢測(cè)卡維地洛對(duì)LX-2纖維化相關(guān)指標(biāo)表達(dá)水平的影響。
　　按實(shí)驗(yàn)分組將細(xì)胞接種子6孔板中，藥物處理后提取細(xì)胞總RNA或蛋白，采用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)LX-2中Ⅰ型膠原(Col1)和纖連蛋白(FN)的mRNA表達(dá)水平。Western Blot檢測(cè)FN和α-SMA蛋白表達(dá)水平。
　　5.Western Blot檢測(cè)卡維地洛對(duì)LX-

9、2通路相關(guān)蛋白的影響。按實(shí)驗(yàn)分組將細(xì)胞接種于6孔板中，藥物處理后提取細(xì)胞總蛋白，利用Western blot技術(shù)檢測(cè)信號(hào)通路相關(guān)蛋白（PDGFRβ、PI3K、Akt及Erk）蛋白表達(dá)或磷酸化水平。
　　結(jié)果：
　　1.卡維地洛可抑制HSCs增殖。
　　CCK-8細(xì)胞增殖能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)顯示，卡維地洛明顯抑制了HSCs的增殖能力，呈濃度依賴性。IC50=28.42μM。
　　2.卡維地洛抑制了HSCs的遷移能力和侵襲能

10、力。
　　劃痕實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別顯示，PDGF-BB可誘導(dǎo)HSCs遷移能力和侵襲能力增加，卡維地洛處理后的HSCs遷移能力和侵襲能力隨濃度增加逐漸減弱。
　　3.卡維地洛抑制了PDGF-BB誘導(dǎo)的HSC纖維化作用。
　　Real-time PCR和Western Blot結(jié)果顯示，PDGF-BB可誘導(dǎo)HSCs中Col1和FN的mRNA表達(dá)水平增高，F(xiàn)N和α-SMA的蛋白表達(dá)水平增高，卡維地洛處理可抑制這種增高。

11、r>　　4.PDGFR/Akt通路介導(dǎo)了卡維地洛的抗纖維化作用。
　　Western Blot結(jié)果顯示，PDGF-BB可誘導(dǎo)HSCs中PDGFRβ(Tyr751)和Akt磷酸化增高，卡維地洛可抑制這種增高，PDGF-BB可輕度增高PI3K表達(dá)，但卡維地洛對(duì)PI3K表達(dá)無(wú)明顯影響。
　　結(jié)論：
　　1.卡維地洛可抑制HSCs增殖。
　　2.卡維地洛可抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的HSCs的遷移、侵襲作用。
　　3.

12、卡維地洛可抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的HSCs纖維化作用。
　　4.卡維地洛對(duì)HSCs纖維化作用的影響可能通過(guò)PDGFR/Akt通路發(fā)揮作用。
　　第二部分卡維地洛通過(guò)抗血管形成對(duì)肝纖維化的作用研究
　　目的：
　　觀察卡維地洛對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)功能及血管形成作用的影響，并進(jìn)一步研究其內(nèi)在機(jī)制，同時(shí)觀察卡維地洛對(duì)其鞘氨醇激酶脂酶1(SK1)表達(dá)的影響。
　　方法：
　　1.CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖

13、水平
　　按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的分組（空白對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照以及藥物處理）情況，將細(xì)胞分入96-孔培養(yǎng)板培養(yǎng)。24h后進(jìn)行CCK8分析，檢測(cè)卡維地洛對(duì)HUVEC增殖的影響。
　　2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。
　　按實(shí)驗(yàn)分組將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，不同濃度的卡維地洛處理后胰酶(無(wú)EDTA)消化，冰PBS洗細(xì)胞，預(yù)冷乙醇固定細(xì)胞，溴化乙錠(PI)及RNase A避光染色后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。
　　3.劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell

14、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力
　　按實(shí)驗(yàn)分組將細(xì)胞接種于6孔板中，200μL滅菌移液器槍頭沿培養(yǎng)板劃直線，加入VEGF及濃度梯度的卡維地洛處理24h后圖像采集。按實(shí)驗(yàn)分組將細(xì)胞接種于鋪有基質(zhì)膠的Transwell小室上室，同時(shí)加入不同濃度的卡維地洛，下室加入VEGF。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后取出上室，剪下底部膜染色，光學(xué)顯微鏡下圖像采集并計(jì)數(shù)。
　　4.成管實(shí)驗(yàn)進(jìn)行血管形成能力檢測(cè)。
　　按實(shí)驗(yàn)分組將細(xì)胞接種于鋪好基質(zhì)膠的96

15、孔板，加入VEGF和濃度梯度的卡維地洛處理8-12h后采集圖像。
　　5.Western blot檢驗(yàn)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白變化
　　按實(shí)驗(yàn)分組將細(xì)胞接種于6孔板中，加入不同濃度的卡維地洛和VEGF處理后，提取細(xì)胞蛋白，利用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VEGFR-2、Erk和Src蛋白磷酸化水平的改變。
　　6.Real-time PCR及Western blot檢驗(yàn)細(xì)胞SK1表達(dá)水平
　　不同濃度的卡維地洛和VE

16、GF處理后的細(xì)胞分別提取RNA及總蛋白，分別利用real-time PCR及Western blot檢測(cè)卡維地洛對(duì)HUVEC中SK1的mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果：
　　1.卡維地洛可抑制HUVECs增殖。
　　CCK-8細(xì)胞增殖能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)顯示，卡維地洛明顯抑制了HUVECs的增殖能力，呈濃度依賴性。IC50=38.5μM。
　　2.卡維地洛誘導(dǎo)了HUVECs的G1期停滯。
　　流式細(xì)胞儀檢測(cè)

17、細(xì)胞周期結(jié)果顯示:卡維地洛處理HUVECs后造成細(xì)胞G0/G1期延長(zhǎng)(P＜0.05 vs control)，伴隨S和M期的縮短。
　　3.卡維地洛抑制了HUVECs的遷移能力和侵襲能力。
　　劃痕實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別顯示，VEGF可誘導(dǎo)HUVEC遷移能力和侵襲能力增加，卡維地洛處理后的HUVECs遷移能力和侵襲能力隨濃度增加逐漸減弱。
　　4.卡維地洛抑制了HUVECs血管形成能力。
　　成管實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VE

18、GF可誘導(dǎo)HUVECs于基質(zhì)膠形成豐富管樣結(jié)構(gòu)，卡維地洛處理后的HUVECs成管能力隨濃度增加逐漸減弱。
　　5.VEGFR2/Src/ERK通路介導(dǎo)了卡維地洛的抗血管形成作用。
　　Western Blot結(jié)果顯示，VEGF可誘導(dǎo)VEGFR-2、ERK1/2和Src磷酸化增高，卡維地洛可抑制這種磷酸化程度的增高，Src激酶抑制劑(PP2)亦可抑制VEGF誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化。
　　6.卡維地洛抑制了HUVECs的

19、SK1表達(dá)。
　　結(jié)果顯示，VEGF誘導(dǎo)了HUVECs巾SK1 mRNA和蛋白水平的增高，卡維地洛處理后抑制了這種增高。
　　結(jié)論：
　　1.卡維地洛可抑制HUVECs的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯。
　　2.卡維地洛可抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVECs的遷移、侵襲和血管形成作用。
　　3.VEGFR2/Src/ERK通路可能是卡維地洛的抗血管形成作用機(jī)制。
　　4.卡維地洛抑制了HUVECs的SK1表達(dá)，可能

20、從而抑制了內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)肝星狀細(xì)胞的旁分泌作用。
　　第三部分外泌體對(duì)肝曼狀細(xì)胞遷移能力的作用及機(jī)制研究
　　目的：
　　研究來(lái)源于內(nèi)皮細(xì)胞的外泌體是否可通過(guò)旁分泌作用于肝星狀細(xì)胞，并影響其生物學(xué)功能。
　　方法：
　　1.小鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LEC)的分離
　　肝組織經(jīng)灌注、收集、切開、剪碎、膠原酶緩沖液消化、與免疫磁珠結(jié)合、分離細(xì)胞后，種入含Ⅰ型膠原的培養(yǎng)皿。標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)。
　　2.慢病毒

21、轉(zhuǎn)染產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞系
　　設(shè)計(jì)SK1顯性失活突變(D81A)模板和SK1組成性激活突變(G113A)模板。利用293T細(xì)胞產(chǎn)生慢病毒并轉(zhuǎn)導(dǎo)入TSEC形成表達(dá)SK1野生型、SK1 D81A突變和G113A突變的穩(wěn)定細(xì)胞系。并分別從此三種細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基中提取外泌體。
　　3.外泌體純化
　　分別從血清和細(xì)胞培養(yǎng)上清中采用梯度離心法提取外泌體。采用WesternBlot、納米顆粒追蹤分析和電鏡免疫金標(biāo)記對(duì)外泌體進(jìn)行鑒定。<

22、br>　　4.免疫熒光、共聚焦顯微鏡和圖片定量
　　4％多聚甲醛固定細(xì)胞，封閉，一抗孵育，洗片，二抗孵育，洗片，DAPI染核，洗片，封片液封片后置于熒光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行圖像采集。
　　5.納米顆粒追蹤分析
　　外泌體樣本以4-8×108個(gè)/mL濃度裝載入NanoSight NS300設(shè)備，記錄3段30s視頻，進(jìn)而分析囊泡的外觀、大小和密度進(jìn)行。
　　6.Western Blot及Real-time PCR

23、>　　常規(guī)方法進(jìn)行Western Blot及Real-time PCR檢測(cè)。
　　7.Transwell遷移實(shí)驗(yàn)
　　通過(guò)Transwell小室檢測(cè)外泌體及各類成分對(duì)HSC遷移能力的影響。
　　8.透射電子顯微鏡和免疫金標(biāo)
　　樣本經(jīng)多聚甲醛固定、載入電鏡網(wǎng)格、洗滌、一抗孵育、洗滌、金標(biāo)二抗孵育洗滌、戊二醛固定、染色后使用透射電鏡觀察并采集圖像。
　　9.掃描電子顯微鏡
　　樣本經(jīng)固定、洗滌、再固定、

24、脫水、干燥、封片、濺射鍍膜后使用掃描電鏡觀察并采集圖像。
　　10.生物素分析法檢測(cè)細(xì)胞膜表面整合素活性
　　外泌體處理細(xì)胞后，使用生物素對(duì)細(xì)胞表面蛋白進(jìn)行標(biāo)記，收集裂解液并與蛋白G瓊脂糖珠結(jié)合后獲得蛋白樣本，常規(guī)Western Blot法檢測(cè)目的蛋白。
　　11.動(dòng)物處理
　　C57BL/6小鼠接受CCl4腹腔注射或膽總管結(jié)扎手術(shù)建立肝纖維化模型。同時(shí)根據(jù)具體需要給予相應(yīng)藥物處理。
　　12.天狼猩紅染色

25、
　　肝組織石蠟切片脫蠟后使用天狼猩紅+固綠染液染色，脫水封片后光鏡下圖像采集。
　　結(jié)果：
　　1.我們提取的外泌體特點(diǎn)為:直徑80-100nm，杯狀雙層膜形態(tài)，CD81、TfR和CD63免疫金染色陽(yáng)性， WB檢測(cè)到TSG101、TfR、CD63等特征性外泌體標(biāo)志物。微陣列分析顯示成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)-2會(huì)誘導(dǎo)EC中SK1mRNA水平增高2.4倍。
　　2.外泌體處理HSC后會(huì)同時(shí)造成AKT磷酸化8.3

26、倍增高和遷移的2.5倍增加。SK1過(guò)表達(dá)EC細(xì)胞系來(lái)源的外泌體會(huì)使HSC遷移增高3.2倍。顯性失活SK1細(xì)胞的外泌體不能誘導(dǎo)HSC遷移。
　　3.Western Blot和透射電鏡發(fā)現(xiàn)外泌體表達(dá)基質(zhì)蛋白和整合素配體FN。通過(guò)CD20中和抗體或RGD肽阻斷FN與整合素相互作用后，外泌體誘導(dǎo)的HSCAKT磷酸化和遷移降低。
　　4.通過(guò)發(fā)動(dòng)蛋白siRNA轉(zhuǎn)染、發(fā)動(dòng)蛋白GTP酶顯性失活結(jié)構(gòu)DynK44A轉(zhuǎn)染或藥理學(xué)抑制劑Dynas

27、ore抑制內(nèi)吞作用后，外泌體誘導(dǎo)的AKT磷酸化明顯降低。外泌體內(nèi)吞入細(xì)胞后，先出現(xiàn)在早期內(nèi)吞體，隨后出現(xiàn)在溶酶體區(qū)域。
　　5.肝纖維化模型小鼠血清來(lái)源外泌體中SK1水平增高，肝硬化患者肝組織中SK1 mRNA水平有2.5倍增高。
　　6.S1PR2抑制可保護(hù)CCl4引起的小鼠肝纖維化。
　　結(jié)論：
　　內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的含SK1的外泌體可通過(guò)依賴FN-整合素的粘附和依賴發(fā)動(dòng)蛋白的內(nèi)吞調(diào)節(jié)HSC的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和遷移。外泌