HmgD過量表達對果蠅化蛹及血細胞發(fā)育影響機制的研究.pdf

1、果蠅是重要的模式生物，其在遺傳學、分子生物學、發(fā)育生物學等領域中有著突出的貢獻。此外，在對果蠅和人類基因組的比較中發(fā)現(xiàn)，三分之二引發(fā)人類疾病的基因(包括與癌癥有關的基因)在果蠅中都存在類似的基因。HMGD蛋白最早由Bassuk等從果蠅胚胎細胞的核中分離得到，是果蠅中最主要的HMG蛋白，由HmgD基因編碼，HmgD基因位于果蠅第二染色體右臂57F10位點。HMGD蛋白含有典型的HMG框結構模式(HMG-box motif)，是哺乳動物中H

2、MGB蛋白的同系物。HMGD蛋白分子量小、分布豐度較大，具有染色質構建因子的功能，參與染色質的組裝。HMGD蛋白通過結合DNA并使之發(fā)生彎曲，為組裝核蛋白復合物提供方便。此外，HMGD是一種母型蛋白，在卵巢和胚胎發(fā)育的中囊胚過渡之前豐度最大，對于最初的胚胎發(fā)育非常重要。有研究表明，在果蠅發(fā)育的中囊胚過渡之前，HMGD可以取代H1參與染色質的組裝，但HMGD參與形成的染色質結構較為疏松，這有利于胚胎發(fā)育早期的快速卵裂。但另有實驗表明，HM

3、GD和Hl沒有相同的結合DNA的特征，而且HMGD不僅在雌性成體和早期胚胎中表達，在胚胎發(fā)育的后期以至整個發(fā)育時期都有表達。因此，HMGD可能不僅僅在果蠅早期胚胎發(fā)育過程中具有參與染色質構建的功能，很可能在果蠅整個發(fā)育過程中具有其它重要的尚未可知的功能。 本研究采用LIAS-Gal4系統(tǒng)，通過功能獲得性突變的方法研究了在廣泛表達的Gal4驅動子(ActGal4)的控制下過量表達HmgD對果蠅化蛹及血細胞發(fā)育影響的分子機制。結果表

4、明，HmgD廣泛過量表達突變體幼蟲在一齡和二齡期發(fā)育正常，而在三齡幼蟲化蛹時發(fā)育異常，發(fā)育停滯在三齡幼蟲末期至預蛹的階段，即HmgD過量表達的幼蟲不能正?；?。采用喂食蛻皮激素的方法，也不能挽救突變表型，說明過量表達 HmgD沒有影響果蠅體內蛻皮激素的合成和釋放，而可能是過量表達HmgD影響了蛻皮激素信號途徑相關基因的表達。分別提取三齡幼蟲中期、后期至預蛹前的各時期幼蟲RNA，用RT-PCR的方法檢測了蛻皮激素受體基因的表達情況。結果顯

5、示，與野生型相比，過量表達HmgD突變體中三齡幼蟲蛻皮激素受體基因EcR-A、EcR-C的轉錄沒有發(fā)生顯著變化，而異構體EcR—B卻沒有表達。表明過量表達 HmgD可能抑制了蛻皮激素受體基因EcR—B，從而導致幼蟲化蛹失敗。EcR-B缺失突變體的發(fā)育缺陷也和本研究系統(tǒng)中的突變幼蟲表型一致，進而說明HMGD過量表達，通過抑制了蛻皮激素受體基因EcR-B的表達，導致蛻皮激素受體途徑下游基因如E75表達紊亂，從而引起化蛹失敗。 本研究

6、組前期工作發(fā)現(xiàn)，過量表達HmgD引起果蠅幼蟲體內血細胞增生，并出現(xiàn)黑色素瘤，為探討HmgD過量表達導致了血細胞增生即形成黑色素瘤的分子機制，本研究分別提取三齡中期、后期和相對于野生型化蛹前時刻的幼蟲的RNA，首先檢測了編碼酚氧化酶(PO)級聯(lián)反應途徑中的兩個關鍵基因．PPAE，Spn27A在突變體中的轉錄發(fā)生變化，結果發(fā)現(xiàn)，Spn27A在三齡中期的表達量低于野生型，而PPAE的表達高于野生型，表明過量表達HmgD影響了酚氧化酶級聯(lián)反應途

7、徑，低水平的Spn27A不足以抑制PPAE的活性，活化的PPAE催化了PPO的活性，使其轉變成有活性的PO，從而促進黑色素的生成，使果蠅體內產生黑色素瘤。因此我們推測，HMGD可能參與果蠅的免疫反應，這和脊椎動物炎癥細胞中檢測到高濃度的HMGB1蛋白一致。之后我們又發(fā)現(xiàn)，過量表達HmgD引起編碼核小體重組因子NURF催化亞單位ISWI基因高表達，編碼細胞周期蛋白A、E的基因cyclinA、cyclinE高表達?？赡苓@些途徑相互作用，導致