福壽螺多功能纖維素酶EGXA及其結(jié)構(gòu)域在昆蟲細(xì)胞Tn5中的重組表達(dá)與性質(zhì)分析.pdf

1、纖維素(Cellulose)是生物界含量最豐富的可再生性碳源。纖維素酶(Cellase)是能將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的一系列酶的總稱。纖維素酶在降解利用纖維素作為能源物質(zhì)的過程中起到關(guān)鍵性的作用，因此對纖維素酶的深入研究不僅可以豐富酶學(xué)研究的理論基礎(chǔ)，還具有巨大的應(yīng)用價值。 從福壽螺(Ampullarm crossean)胃液中分離純化得到一種分子量為41.5KDa的多功能纖維素酶，稱為EGX，具有水解對.硝基酚纖維二糖苷(pNPC

2、)、微晶纖維素(Sigmacell)、羧甲基纖維素(CMC-Na)、Birch啪d的可溶性木聚糖(soluble xylan prepped from xylm frombirchwood)以及Oat spelt的木聚糖(xylan fom oat spelt)等5種底物的能力，即該酶是一種具有外切-β-1，4-葡聚糖酶、內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶和內(nèi)切-β-1,4-木聚糖酶三種活力的多功能纖維素酶。根據(jù)EGX氨基酸的核心序列從福壽螺基

3、因組中克隆得到纖維酶基因egxa，長1.68Kb，結(jié)構(gòu)分析表明由該基因編碼的蛋白序列EGXA具有明顯的催化結(jié)構(gòu)域CD-A和結(jié)合結(jié)構(gòu)域CBM-A。 昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有安全性高，對外源基因克隆容量大，具有完善的翻譯后加工修飾系統(tǒng)和高效表達(dá)外源基因的能力等特點，現(xiàn)已成為基因工程的四大表達(dá)系統(tǒng)(即桿狀病毒、細(xì)菌、酵母、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng))之一。昆蟲細(xì)胞在進(jìn)化上與福壽螺相對而言比較接近，同時具有相似的蛋白表達(dá)加工系統(tǒng)，以及較強

4、的表達(dá)和分泌系統(tǒng)，是真核基因重組表達(dá)及性質(zhì)研究的良好載體。 本實驗分別將EGXA的全長基因egxa，催化結(jié)構(gòu)域基因cd-a以及結(jié)合結(jié)構(gòu)域基因cbm-a在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組EGXA具有多種纖維素酶活力，且催化活性與野生型酶相當(dāng)接近，即重組EGXA同樣具有外切-β-1，4-葡聚糖酶、內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶和內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶三種活力。熒光酰肼標(biāo)記染色發(fā)現(xiàn)，胞外分泌表達(dá)的EGXA被糖基化修飾，推測糖基化可能對EG

5、XA的酶活具有重要貢獻(xiàn)。獨立表達(dá)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域CBM-A具有結(jié)合纖維素大分子不溶性底物sigmacell的能力。而重組表達(dá)的獨立催化結(jié)構(gòu)域CD-A則沒有纖維素水解活力，或者說活力很低，以至于檢測不到。 本研究成功地將福壽螺內(nèi)源性纖維素酶基因egxa在真核表達(dá)系統(tǒng)--昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中實現(xiàn)表達(dá)，這對動物纖維素酶研究來說是個重要的突破和補充?？上驳氖侵亟MEGXA具有的催化活力與野生型酶極其相似，可以作為動物纖維素酶研究的重要參