發(fā)干線粒體DNA提取改良法的建立、缺失類型的篩選及其缺失量與年齡的關系.pdf

1、毛發(fā)是犯罪現(xiàn)場上最常見的物證檢材之一。發(fā)干的傳統(tǒng)方法檢驗主要集中在形態(tài)學的對比上。隨著毒化技術和分子生物學技術的發(fā)展和運用，發(fā)干分析檢驗內(nèi)容已經(jīng)成功地擴展到毒化分析和個人識別領域。但目前，對于發(fā)干的年齡推斷仍然沒有可靠有效的方法。不帶毛囊的發(fā)干的主要成分是角質(zhì)蛋白和微量的線粒體DNA。線粒體DNA缺失在衰老過程中扮演著重要的角色，并且其缺失量有隨著年齡增加而增加的趨勢，因而，線粒體DNA缺失或許可以成為發(fā)干年齡推斷研究的切入口。

2、 前期的研究已經(jīng)證實，mtDNA的多種大片段缺失與年齡存在密切的關系，例如：13162bp、7663bp、7634bp、10422bp、4989bp和4977bp缺失等。但這些缺失類型是否存在于發(fā)干當中、其缺失量與發(fā)干的年齡關系如何仍然未見系統(tǒng)的研究報道。 此外，從發(fā)干中提取線粒體DNA仍然是一個難點，雖然國內(nèi)外文獻均有相關方法的研究報道，但在實際運用中均存在缺點。分析發(fā)干提取中的影響因素及建立適合本實驗的方法是研究毛發(fā)mtDN

3、A缺失情況的前提條件之一。 研究目的： 本研究主要探討發(fā)干中提取mtDNA的方法、發(fā)干中mtDNA缺失類型及其缺失量與年齡的關系： (1)對比多種從發(fā)干中提取mtDNA的技術，并建立經(jīng)濟、高效和適合本實驗的方法。 (2)明確發(fā)干中是否存在線粒體DNA13162bp、7663bp、7634bp、10422bp、4989bp和4977bp缺失，以探討缺失類型及其缺失發(fā)生率與年齡的關系。 (3)分析不同

4、年齡發(fā)干線粒體DNA缺失的量，明確缺失量與年齡的關系，探討mtDNA缺失實時定量技術在發(fā)干年齡推斷中的運用價值，嘗試建立毛發(fā)年齡推斷的新指標。 主要研究的內(nèi)容及結(jié)果 第一部分多種發(fā)干mtDNA提取方法的對比及改良方法的建立 1.1.利用chelex-100法對20份無染色發(fā)干mtDNA進行提取和PCR擴增，其擴增成功率為75％。 1.2利用NaOH法對20份無染色發(fā)干mtDNA進行提取和PCR擴增，其擴增

5、成功率為70％。 1.3利用壓發(fā)機對發(fā)干進行碾壓破壞其外層蛋白結(jié)構(gòu)后，采用自配消化液(100mmol/l Tris—HC1,1mmol/l EDTA,1％ TritonX-100,1mg/ml蛋白酶K,80mmol/l DTT)進行發(fā)干消化，建立改良法。對20份無染色發(fā)干mtDNA進行提取和PCR擴增，其擴增成功率為90％。 1.4利用NaOH法對10份染色發(fā)干mtDNA進行提取和PCR擴增，其擴增成功率為50％。

6、 1.5利用chelex-100法結(jié)合Microcon100純化柱對10份染色發(fā)干mtDNA進行提取和PCR擴增，其擴增成功率為80％。 1.6單純利用改良法對10份染色發(fā)干mtDNA進行提取和PCR擴增，其擴增成功率為20％。結(jié)合DNA吸附純化柱純化后，其擴增成功率為80％。 第二部分發(fā)干mtDNA缺失類型的篩選 2.1針對4977bp缺失類型，在缺失位點兩側(cè)設計特異性引物對90份不同年齡的發(fā)干進行PCR篩選

7、，并對陽性模板進行測序認證。有89份樣品檢測到4977bp缺失，其缺失發(fā)生率為98.9％，測序結(jié)果顯示其缺失片段大小為4977bp，與理論值一致。 2.2針對13162bp、7663bp、7463bp、10422bp和4989bp等缺失類型，在缺失位點兩側(cè)設計特異性引物對90份不同年齡的發(fā)干進行PCR篩選，均未發(fā)現(xiàn)其PCR擴增產(chǎn)物。 2.3對陰性模板的擴增條件進行優(yōu)化，在采取更換PrimeSTAR HS DNAPolym

8、erase、提高Mg2+濃度、采用二次擴增的方法等提高擴增體系靈敏度等措施后，仍未檢見13162bp、7663bp、7463bp、10422bp和4989bp缺失的目的片段。 第三部分mtDNA4977bp缺失實時定量PCR探針法的建立與不同年齡發(fā)干缺失量的分析 3.1分別擴增mtDNA4977bp缺失和MTND1基因，并連接到PMD-19 T載體上，經(jīng)過藍白斑篩選、PCR擴增篩選和測序認證，成功構(gòu)建mtDNA4977b

9、p缺失重組質(zhì)粒和MTND1重組質(zhì)粒。 3.2分別以MTND1和mtDNA4977bp缺失標準品進行10的倍數(shù)稀釋后，取六個濃度進行擴增(從1×10-5 pg至1 pg)，MTND1標準品的CT值與起始模板量的關系公式為y=-1.34ln(x)+17.54，R2=0.9977，R2>0.99，兩者之間具有良好的依存關系；mtDNA4977bp缺失標準品的CT值與起始模板量的關系公式為y=-1.37ln(x)+18.11，R2=0.

10、9984，R2>0.99，兩者之間具有良好的依存關系； 3.3對90份從5天至91歲的不同年齡發(fā)干樣品進行mtDNA4977bp缺失定量，共有89份樣品檢測到mtDNA4977bp缺失，陽性率為98.9％，缺失量為0至1.436％±0.2086％之間， 3.4統(tǒng)計學分析顯示mtDNA4977bp缺失與年齡之間存在一定的相關性(r=0.639，P<0.05)，并且有隨著年齡的增長而增長的趨勢。數(shù)學模型建立中最佳的關系公式為

11、y=2E—05e0.042x(R2=0.408, P<0.05)。 結(jié)論： 1.在非染色發(fā)干提取中，本實驗建立的改良法的PCR擴增成功率高于chelex-100法和NaOH法，并且成本低廉，適合大樣品提取使用。 2.在染色發(fā)干提取中，改良法結(jié)合DNA吸附純化柱的PCR擴增成功率與chelex-100法結(jié)合Microcon100純化柱無統(tǒng)計學差別，但成本更為低廉，僅為后者的1/10。 3.本實驗90份發(fā)干樣

12、品中未檢測到線粒體DNA13162bp、7663bp、7463bp、10422bp和4989bp缺失。 4.線粒體DNA4977bp缺失是在發(fā)干樣品中普遍存在，并且在20歲以下的發(fā)干樣品中具有很高的發(fā)生率。 5.發(fā)干中mtDNA4977bp缺失量有隨著年齡的增長而增加的趨勢，兩者的相關性為r＝0.639 6.發(fā)干中mtDNA4977bp缺失量與年齡之間的最佳數(shù)學模型公式為：y=2E—05e0.042x(R2=0.