電致化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)人類甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT1)活性的研究.pdf

1、在哺乳動(dòng)物的體內(nèi)有三種不同的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，它們分別是DNMT1，DNMT3A和DNMT3B。其中，含量最豐富的是DNMT1，被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物中最關(guān)鍵的甲基轉(zhuǎn)移酶。實(shí)驗(yàn)表明DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的異常與許多類型的遺傳缺陷和眾多的惡性腫瘤密切相關(guān)，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的異常會(huì)導(dǎo)致異常的DNA甲基化。目前，許多研究結(jié)果已經(jīng)證明，低甲基化和超甲基化存在于多種癌癥中，像宮頸癌、卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌、泌尿道癌、白血病等。胞嘧啶的DNA的甲基化是最

2、常見(jiàn)的甲基化形式，其過(guò)程是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化下，將S-腺苷甲硫氨酸中的甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到CpG位點(diǎn)的胞嘧啶上，該甲基化發(fā)生在嘧啶環(huán)的C5位上。最近研究表明了甲基轉(zhuǎn)移酶活性的異常通常比惡性腫瘤其他癥狀的發(fā)生要早許多，因此DNA甲基轉(zhuǎn)移酶是一種潛在的可預(yù)測(cè)的生物標(biāo)記物，可作為不同類型的癌癥的診斷和治療過(guò)程中的藥物作用靶點(diǎn)。因此，發(fā)展簡(jiǎn)單、快速、靈敏且可用于實(shí)際樣品中甲基轉(zhuǎn)移酶活性的方法有著重要的意義。電致化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法將電化學(xué)檢測(cè)和化學(xué)發(fā)光

3、檢測(cè)結(jié)合在一起，和化學(xué)發(fā)光法相比，它無(wú)需發(fā)射光源，實(shí)驗(yàn)背景信號(hào)較低。具有高靈敏度、易操作、儀器易于小型化等優(yōu)點(diǎn)。本文利用電致化學(xué)發(fā)光法，實(shí)現(xiàn)了癌癥細(xì)胞中的人類DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性高靈敏的檢測(cè)。本課題旨在建立對(duì)某些疾病早期細(xì)胞的甲基化水平檢測(cè)的方法，為早期的診斷和治療提供理論依據(jù)。
　　1.建立了電致化學(xué)發(fā)光(ECL)生物傳感器來(lái)檢測(cè)癌細(xì)胞中甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT1)活性。在這個(gè)工作中，MPA修飾的摻Eu3+的CdS量子點(diǎn)(MPA-C

4、dS∶EuNCs)作為電致化學(xué)發(fā)光的發(fā)射體。修飾了MPA-CdS∶Eu NCs的玻碳(GCE)電極上連接半甲基化的雙鏈DNA，當(dāng)與DNMT1和SAM作用后，半甲基化序列5'-CGCGCG-3'的胞嘧啶C被甲基化，形成全甲基化雙鏈DNA，之后再與限制性核酸內(nèi)切酶BssHⅡ作用。經(jīng)過(guò)BssHⅡ剪切后，半甲基化的雙鏈DNA上剩余的3'端凹陷的部分能夠繼續(xù)被ExoⅢ消化掉。留在電極上的單鏈DNA部分會(huì)與primeDNA進(jìn)行雜交，這樣就引發(fā)了一個(gè)

5、雜交鏈反應(yīng)。形成一個(gè)G-四聯(lián)體/血紅素DNA酶的超級(jí)雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，大大降低ECL的信號(hào)。因?yàn)锽ssHⅡ只能對(duì)半甲基化的序列進(jìn)行剪切，因此，甲基轉(zhuǎn)移酶的活性越高，全甲基化雙鏈DNA越多，被剪切的越少?；谏鲜龅倪^(guò)程，實(shí)現(xiàn)了對(duì)檢測(cè)細(xì)胞中的DNMT1活性的高靈敏度檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度差（全甲基化之前與形成G-四聯(lián)體的DNA酶之后的強(qiáng)度差）與DNMT1的活性有很好的線性，在信噪比為3時(shí)，檢測(cè)限可達(dá)到0.09U/mL，而且該生物

6、傳感器可應(yīng)用于人肺癌細(xì)胞(A549)中DNMT1的檢測(cè)，它的檢測(cè)限可達(dá)到2個(gè)A549細(xì)胞。為了驗(yàn)證該實(shí)驗(yàn)方法在臨床上的應(yīng)用，進(jìn)一步檢測(cè)了另外兩種癌癥細(xì)胞(人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人宮頸癌細(xì)胞Hela)和一種正常的人胚腎細(xì)胞(HKE-293)中的DNMT1的活性。結(jié)合DNMT1標(biāo)準(zhǔn)試劑盒實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以HKE-293為基準(zhǔn)，其余細(xì)胞對(duì)DNMT1的相關(guān)性進(jìn)行換算，結(jié)果表明人類癌癥細(xì)胞對(duì)于DNMT1是高表達(dá)的，在生物醫(yī)學(xué)的研究有著潛在價(jià)值。

7、>　　2.通過(guò)構(gòu)建雙信號(hào)比率計(jì)算電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器來(lái)檢測(cè)人類甲基轉(zhuǎn)移酶活性。該方法以CdS∶Eu NCs和魯米諾為信號(hào)發(fā)射體，其中CdS∶Eu NCs修飾在玻碳電極表面，而魯米諾存在于實(shí)驗(yàn)檢測(cè)液中。首先，半甲基化的發(fā)卡S1DNA連接在修飾了CdS∶Eu NCs的玻碳電極上。之后將S2DNA與Au NPs共同作用形成了S2DNA-Au NP的結(jié)構(gòu)與連接在GCE電極上的S1DNA進(jìn)行雜交，形成了S1&S2/GCE的電極組裝結(jié)構(gòu)。接下來(lái)，

8、DNMT1和SAM進(jìn)行甲基化作用，其中一部分的半甲基化的雙鏈DNA全甲基化。因?yàn)橄拗菩院怂醿?nèi)切酶BssHⅡ?qū)谆舾?，只能剪切半甲基化或者未甲基化?'-GCGCGC-3'序列，此時(shí)全甲基化的雙鏈DNA不能夠被接下來(lái)的限制性內(nèi)切酶BssHⅡ進(jìn)行剪切，其他沒(méi)有全甲基化的雙鏈DNA能夠被剪切。之后，與核酸外酶ExoⅢ進(jìn)行作用，BssHⅡ作用后的半甲基化DNA雙鏈結(jié)構(gòu)中鏈接了AuNP的S1DNA部分被消化成片段，AuNPs脫離電極?；贑d

9、S∶Eu NCs和Au NPs之間的RET-SPR作用，以及AuNPs作為生物傳感器的電傳感原件對(duì)電致化學(xué)發(fā)光劑魯米諾有優(yōu)越的催化作用，此時(shí)的CdS∶Eu NCs的強(qiáng)度有部分的恢復(fù)，而魯米諾的強(qiáng)度降低，通過(guò)CdS∶Eu NCs和魯米諾強(qiáng)度的比值來(lái)檢測(cè)DNMT1的活性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法可以用來(lái)檢測(cè)DNMT1的活性，它的最低檢測(cè)限為0.07U/mL。比之傳統(tǒng)的單信號(hào)源方法更加的準(zhǔn)確。實(shí)驗(yàn)同樣可用于對(duì)甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的評(píng)估，對(duì)抗癌藥物