土壤細(xì)菌16S rRNA基因V3區(qū)種屬特異性檢測(cè)的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究.pdf

1、人類以各種形式研究土壤并將其應(yīng)用于案件調(diào)查已有上千年的歷史。在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，土壤被作為和案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)有關(guān)的可疑物證，以前主要是基于地質(zhì)學(xué)特征加以區(qū)別。但案件中所涉及的土壤樣品大多微量，制約了土壤這一重要物證在法醫(yī)學(xué)上的廣泛應(yīng)用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，拓展了人們對(duì)土壤微生物的認(rèn)識(shí)，對(duì)土壤微生物群體DNA多樣性研究日益增多。 微生物是一群體形微小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、低等生物的總稱，與其他環(huán)境相比土壤中的微生物數(shù)量最大，種類也最多。生活在土

2、壤中的微生物由于營(yíng)養(yǎng)和生態(tài)位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)、相互影響和制約，形成了一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的土壤微生物群落。土壤微生物不僅是土壤中物質(zhì)循環(huán)的驅(qū)動(dòng)力，其代謝物也是植物的營(yíng)養(yǎng)成分，其活動(dòng)能直接影響到土壤的物理、化學(xué)性質(zhì)。不同地點(diǎn)土壤樣品間的微生物群體，由于土壤成分及周圍環(huán)境差異，其種類和數(shù)量呈現(xiàn)出明顯的多樣性。因此對(duì)微量土壤檢材進(jìn)行微生物檢測(cè)，有著重要的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。 目前在生態(tài)學(xué)和環(huán)境科學(xué)的研究領(lǐng)域，關(guān)于土壤微生物尤其是土壤中微生物多樣性的研究越

3、來(lái)越受到重視。大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，在蛋白質(zhì)、DNA和RNA等可被看作是分子計(jì)時(shí)器的生物大分子中，最適合于揭示各類生物親緣關(guān)系的是rRNA，尤其是16S rRNA。核糖體16S rRNA(16S rRNA)基因是細(xì)菌染色體上編碼rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列，它集保守性與變異性于一身，是目前應(yīng)用最廣的分子微生物學(xué)檢測(cè)的靶基因。目前，國(guó)內(nèi)法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域尚無(wú)關(guān)于土壤細(xì)菌16S rRNA基因方面的相關(guān)研究。本研究擬采用變性梯度凝膠電泳技術(shù)以土壤微生物群

4、體的基因組DNA為研究對(duì)象，通過(guò)比較不同土壤中各種微生物的16S rRNA 基因信息了解微生物的多樣性，初步判斷土壤樣品的來(lái)源，進(jìn)而為解決微量土壤物證檢材檢測(cè)開拓一種新的途徑。 具體研究思路如下：以CTAB、溶菌酶和蛋白酶K裂解細(xì)胞，用PEG 8000沉淀和純化DNA，直接對(duì)土壤微生物總DNA進(jìn)行提取，選擇特異性引物F357GC和R518對(duì)16S rDNAV3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)變性梯度凝膠電泳(DGGE)進(jìn)行分離后，得到不

5、同數(shù)目的電泳條帶。通過(guò)對(duì)電泳條帶位置及數(shù)量的比較，初步判斷土壤樣品的來(lái)源。 材料與方法： 1、隨機(jī)選取兩個(gè)采樣點(diǎn)(A、B)分別取地表、距地表10cm、20cm、30cm四個(gè)深度不同量的土壤樣本(300mg、200mg、100mg、80mg、60mg)。 2、采用CTAB-溶菌酶-蛋白酶K-凍融裂解法對(duì)土壤樣本總DNA進(jìn)行提取，用PEG8000沉淀和純化DNA。 3、選擇特異性引物F357CJC和R518對(duì)

6、土壤細(xì)菌16S rDNAV3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。 4、采用紫外分光光度計(jì)與瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。 5、采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和變性梯度凝膠電泳(DGGE)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)分析。 結(jié)果： 1、采用紫外分光光度計(jì)對(duì)待檢土壤樣品進(jìn)行檢測(cè)，其OD260/280均分布在1.5～1.68之間。 2、瓊脂糖凝膠電泳顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度在230bp左右，是目的片段。 3、經(jīng)PCR-D