脈沖電磁場(chǎng)對(duì)雪旺細(xì)胞的激活作用及其在周?chē)窠?jīng)損傷修復(fù)中的應(yīng)用.pdf

1、周?chē)窠?jīng)損傷是臨床上常見(jiàn)的創(chuàng)傷類(lèi)型，尤其是長(zhǎng)節(jié)段的神經(jīng)缺損一直是最為棘手的治療難題之一。雖然自體周?chē)窠?jīng)移植可以促進(jìn)神經(jīng)再生并恢復(fù)一定的功能，然而自體神經(jīng)移植具有很大的局限性，如二次手術(shù)損傷和供區(qū)感覺(jué)等功能的缺失。此外，供體神經(jīng)來(lái)源有限以及供、受體神經(jīng)直徑不匹配等因素也限制了自體神經(jīng)移植的應(yīng)用。越來(lái)越多的學(xué)者嘗試用組織工程神經(jīng)支架來(lái)修復(fù)神經(jīng)缺損，而對(duì)于長(zhǎng)節(jié)段的神經(jīng)缺損，單純依靠支架材料進(jìn)行修復(fù)往往存在神經(jīng)生長(zhǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，靶肌肉萎縮程度嚴(yán)重

2、等現(xiàn)象，修復(fù)效果并不理想。大量研究表明，在神經(jīng)修復(fù)材料局部構(gòu)建良好的生物學(xué)微環(huán)境，是決定神經(jīng)缺損修復(fù)效果的關(guān)鍵。有研究表明將種子細(xì)胞復(fù)合在神經(jīng)支架內(nèi)部，可改善神經(jīng)再生的微環(huán)境，起到有效的促神經(jīng)再生作用。雪旺細(xì)胞作為周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)的主要膠質(zhì)細(xì)胞，在周?chē)窠?jīng)損傷的修復(fù)中具有非常重要的作用，也是最常用的種子細(xì)胞之一。然而，雪旺細(xì)胞經(jīng)分離培養(yǎng)后，其合成及分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞粘附分子的能力顯著下降，不能持續(xù)、高效的合成神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等有利于神經(jīng)再生

3、的分子，在一定程度上限制了雪旺細(xì)胞構(gòu)建神經(jīng)支架局部生物學(xué)微環(huán)境的能力。因此需要尋找一種能方便、有效激活雪旺細(xì)胞，使其保持生物活性的技術(shù)來(lái)解決上述問(wèn)題。有研究表明，電磁場(chǎng)作為一種安全、經(jīng)濟(jì)、無(wú)創(chuàng)、易實(shí)施的物理方法，可有效的調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生物學(xué)性能，包括分化、增殖、凋亡、伸展和遷移等，并且可以促進(jìn)神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)，延緩靶肌肉的萎縮，加速創(chuàng)傷愈合等。本研究應(yīng)用脈沖電磁場(chǎng)（2.0 mT；50Hz）干預(yù)雪旺細(xì)胞4小時(shí)，發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)雪旺細(xì)胞的增殖并激

4、活其合成、分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF，GDNF，VEGF），并進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將雪旺細(xì)胞與神經(jīng)導(dǎo)管相復(fù)合，同時(shí)輔以脈沖電磁場(chǎng)進(jìn)行實(shí)時(shí)刺激，可有效促進(jìn)大鼠12mm坐骨神經(jīng)缺損的修復(fù)，提示了脈沖電磁場(chǎng)可通過(guò)激活移植雪旺細(xì)胞等作用，從而促進(jìn)神經(jīng)的再生和功能的恢復(fù)。
　　第一部分脈沖電磁場(chǎng)參數(shù)的選擇及其對(duì)雪旺細(xì)胞的激活效應(yīng)
　　目的：篩選最佳的磁場(chǎng)參數(shù)，探究脈沖電磁場(chǎng)對(duì)雪旺細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　方法：將接種的

5、雪旺細(xì)胞分為5組，依次以0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mT；50 Hz
　　的脈沖磁場(chǎng)分別干預(yù)各組細(xì)胞4小時(shí)。24小時(shí)后使用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)雪旺細(xì)胞的凋亡，掃描電鏡觀察雪旺細(xì)胞的形態(tài)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果篩選最佳磁場(chǎng)強(qiáng)度。隨后在最佳磁場(chǎng)參數(shù)下分別刺激雪旺細(xì)胞（0.5、1、2、3、4、5、6和8小時(shí)），刺激完成后的24和48小時(shí)應(yīng)用CCK-8檢測(cè)雪旺細(xì)胞的活性，以確定磁場(chǎng)的干預(yù)時(shí)間。
　　將雪旺細(xì)胞在2.0 mT；50Hz

6、的磁場(chǎng)參數(shù)下作用4小時(shí)，采用EdU-labeling量化分析磁場(chǎng)作用后12小時(shí)、24小時(shí)雪旺細(xì)胞的增殖情況，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)脈沖電磁場(chǎng)干預(yù)后雪旺細(xì)胞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子mRNA水平的表達(dá)，ELISA檢測(cè)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌情況。
　　結(jié)果：雪旺細(xì)胞在0.5、1.0、2.0 mT；50 Hz的脈沖電磁場(chǎng)干預(yù)下，無(wú)明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，當(dāng)磁場(chǎng)強(qiáng)度增加至5.0 mT和10.0 mT時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡；掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)當(dāng)磁場(chǎng)強(qiáng)度低于2.0 mT

7、時(shí)，雪旺細(xì)胞的形態(tài)良好，細(xì)胞延展成典型的雙極性形態(tài)，然而當(dāng)磁場(chǎng)強(qiáng)度繼續(xù)升高至5.0 mT時(shí)，雪旺細(xì)胞表面出現(xiàn)空泡，細(xì)胞呈圓形且延展性變差，失去了雪旺細(xì)胞原有的形態(tài)特征。繼續(xù)將磁場(chǎng)強(qiáng)度增加到10.0 mT時(shí)，可以觀察到雪旺細(xì)胞的細(xì)胞膜已碎裂，細(xì)胞形態(tài)完全破壞，雪旺細(xì)胞徹底凋亡。通過(guò)CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在磁場(chǎng)下作用4小時(shí)雪旺細(xì)胞的活性達(dá)到最佳，當(dāng)刺激時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)，其活性并沒(méi)有發(fā)生明顯的變化。
　　雪旺細(xì)胞在脈沖電磁場(chǎng)（2.0 mT；

8、50Hz）干預(yù)后12小時(shí)和24小時(shí)，EdU結(jié)果顯示雪旺細(xì)胞明顯增殖，其合成和分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、GDNF、VEGF的能力也有顯著提高。
　　結(jié)論：2.0 mT；50 Hz為最佳磁場(chǎng)參數(shù)，4小時(shí)為合理干預(yù)時(shí)間；該參數(shù)的脈沖電磁場(chǎng)可有效激活雪旺細(xì)胞，促進(jìn)雪旺細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其合成和分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。
　　第二部分膠原-殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)管的構(gòu)建及相關(guān)性能參數(shù)測(cè)試
　　目的：構(gòu)建具有良好的生物相容性、可降解性的膠原-殼

9、聚糖神經(jīng)導(dǎo)管，并進(jìn)行相關(guān)性能參數(shù)測(cè)試。
　　方法：將膠原與殼聚糖以4:1的比例在冰醋酸中混合，通過(guò)梯度冷淋及冷凍干燥技術(shù)制備膠原-殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)管，掃描電鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)，并對(duì)其孔隙率、體外降解率、吸水膨脹率、抗拉強(qiáng)度進(jìn)行相關(guān)測(cè)定。
　　結(jié)果：掃描電鏡下觀察神經(jīng)導(dǎo)管的橫截面為蜂窩狀多孔立體結(jié)構(gòu)，微孔間彼此連通交錯(cuò)，從而有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸和交換。該導(dǎo)管具備良好的生物相容性、降解性、吸水膨脹性，以及抗拉強(qiáng)度等特點(diǎn)，為再

10、生的神經(jīng)纖維提供了良好的微環(huán)境，同時(shí)其中空樣的結(jié)構(gòu)有利于種子細(xì)胞的移植。
　　結(jié)論：膠原-殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)管具有良好的微觀結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，是一種理想的組織工程神經(jīng)。
　　第三部分雪旺細(xì)胞復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管在脈沖電磁場(chǎng)的作用下修復(fù)坐骨神經(jīng)缺損的有效性研究
　　目的：探究雪旺細(xì)胞作為種子細(xì)胞與神經(jīng)導(dǎo)管相復(fù)合，在脈沖電磁場(chǎng)的刺激下，修復(fù)周?chē)窠?jīng)缺損的有效性。
　　方法：將雪旺細(xì)胞與膠原-殼聚糖導(dǎo)管相復(fù)合，用于修復(fù)大鼠12mm坐骨

11、神經(jīng)缺損，在術(shù)后12周同時(shí)輔以脈沖電磁場(chǎng)刺激（2.0 mT；50Hz），以實(shí)現(xiàn)對(duì)移植雪旺細(xì)胞的實(shí)時(shí)激活，分5組（1自體神經(jīng)移植組；2 Scaffolds組；3 Scaffolds+PMF組；4 Scaffolds+Scs組；5 Scaffolds+Scs+PMF組），對(duì)照比較其神經(jīng)修復(fù)效果的有效性。通過(guò)對(duì)再生神經(jīng)形態(tài)學(xué)（透射電鏡）的觀察和功能學(xué)（熒光金逆行示蹤；坐骨神經(jīng)指數(shù)和神經(jīng)電生理檢測(cè)）的分析以及靶肌肉的染色來(lái)評(píng)價(jià)其修復(fù)效果，并用

12、RT-PCR檢測(cè)再生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)，初步探究其再生機(jī)制。
　　結(jié)果：術(shù)后12周，電磁場(chǎng)作用下的雪旺細(xì)胞與膠原殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合組可觀察到更多均勻分布的軸突，再生神經(jīng)纖維的數(shù)量和直徑明顯高于其他各組，并最接近自體神經(jīng)組。該組靶肌肉 HE染色顯示腓腸肌萎縮情況得到明顯緩解，脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和DRG感覺(jué)神經(jīng)元的數(shù)目顯著高于其他各組，坐骨神經(jīng)指數(shù)的逆轉(zhuǎn)速度高于其他幾組，神經(jīng)傳導(dǎo)速度、潛伏期和波幅也顯著好于其他幾組，并與自體神經(jīng)組無(wú)差異，