影響嵌合孤雌胚胎發(fā)育因素和嵌合囊胚離散細(xì)胞不同性別來(lái)源比率研究.pdf

1、隨著干細(xì)胞技術(shù)的不斷發(fā)展，能夠用于人類再生醫(yī)學(xué)的具有克服免疫排斥反應(yīng)的治療性胚胎干細(xì)胞逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)。通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得的胚胎干細(xì)胞，因?yàn)榫哂信c體細(xì)胞提供者相同的基因型被認(rèn)為是克服免疫排斥反應(yīng)的最佳途徑，然而，取于患病動(dòng)物的體細(xì)胞是一種隱含有突變基因的分化細(xì)胞，不但克隆囊胚生成率很低，而且因含有突變基因，通過(guò)體細(xì)胞克隆途徑所獲得的胚胎干細(xì)胞的質(zhì)量也會(huì)存在問(wèn)題。與此相比，孤雌胚胎干細(xì)胞則因?yàn)槭莵?lái)源于具端粒酶活性且尚未經(jīng)歷個(gè)體

2、分化途經(jīng)的生殖細(xì)胞，理倫上這種來(lái)源于生殖細(xì)胞的干細(xì)胞不存在當(dāng)代受治療動(dòng)物的突變基因，因此，這種孤雌胚胎干細(xì)胞(pES)系的醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景更廣闊，意義重大。同樣，來(lái)源于哺乳動(dòng)物MⅡ期卵母細(xì)胞孤雌激活胚胎與克隆胚胎相比，具有與提供卵母細(xì)胞母體相同的組織相容性復(fù)合物，由此獲得的干細(xì)胞也能夠像體細(xì)胞克隆胚胎干細(xì)胞一樣克服免疫排斥反應(yīng)。但是，來(lái)源于MⅡ期卵母細(xì)胞孤雌激活胚胎則因?yàn)槿狈Ω冈椿蛴≯E作用，其發(fā)育潛能受到限制，從而導(dǎo)致其分離獲得干細(xì)胞的分

3、化潛能也有可能因此而受到限制：由于雄性基因組在胚胎發(fā)育中是必須的，那么，利用MⅡ期卵母細(xì)胞獲得的孤雌胚胎與經(jīng)性別鑒定的雄性胚胎進(jìn)行嵌合發(fā)育，可以在一定程度輔助孤雌胚胎發(fā)育，并且可以用性別鑒定的方法鑒定得到的囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)是否來(lái)源于孤雌胚胎。 本實(shí)驗(yàn)選擇昆白小鼠為研究對(duì)象，針對(duì)孤雌胚胎干細(xì)胞獲取新途徑中，有性生殖胚胎與無(wú)性生殖孤雌胚胎嵌合發(fā)育有可能在早期胚胎細(xì)胞間通過(guò)旁分泌與自分泌因素促進(jìn)孤雌胚發(fā)育的道理，本研究通過(guò)性別鑒定的方法選

4、擇雄性有性生殖胚胎與無(wú)性生殖MⅡ期卵母細(xì)胞孤雌激活胚胎嵌合發(fā)育，并通過(guò)性別鑒定的方法將這種由嵌合發(fā)育囊胚分離得到的細(xì)胞集落進(jìn)行來(lái)源標(biāo)記，旨在通過(guò)應(yīng)用成熟的分子生物學(xué)性別鑒定方法，建立一種新的有性生殖雄性胚胎輔助提高與其嵌合的無(wú)性生殖孤雌胚胎發(fā)育生成囊胚的比率，并進(jìn)一步通過(guò)這種性別鑒定方法，為分離鑒定由此囊胚獲取孤雌胚胎干細(xì)胞的性別標(biāo)識(shí)新模式奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)結(jié)果如下： 1、小鼠孤雌胚胎與雄性胚胎嵌合發(fā)育影響因素研究 本研究取

5、小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活，體外培養(yǎng)至8—細(xì)胞期，與經(jīng)性別鑒定后獲得的8—細(xì)胞期雄性胚胎嵌合培養(yǎng)，其目的是為了建立一種新的異性胚胎嵌合培養(yǎng)模式，在便于通過(guò)分子生物學(xué)方法對(duì)胚胎不同來(lái)源進(jìn)行性別鑒定的基礎(chǔ)上，研究?jī)煞N不同類型胚胎細(xì)胞之間在嵌合發(fā)育過(guò)程中的相互影響，為從嵌合發(fā)育胚胎中分析標(biāo)記來(lái)源于孤雌胚胎的干細(xì)胞研究過(guò)程奠定基礎(chǔ)。本研究在初步建立孤雌激活胚胎與雄性胚胎嵌合發(fā)育程序的基礎(chǔ)上，對(duì)于影響這種嵌合胚胎發(fā)育效果的幾個(gè)主要因素做了進(jìn)一

6、步的研究。 1.1獲取小鼠二倍體孤雌胚胎的孤雌激活方法研究 已知哺乳動(dòng)物孤雌胚胎有幾種染色體核型，孤雌胚胎不同倍性染色體核型的形成與卵母細(xì)胞孤雌激活的方式有關(guān)，其中雜合二倍體是一種在染色體質(zhì)量上類似于有性生殖胚胎體細(xì)胞核型的無(wú)性生殖孤雌胚胎，為了獲取這種胚胎，本研究通過(guò)兩種化學(xué)方法激活昆白小鼠成熟卵母細(xì)胞，并抑制其第二極體排出，在顯微操作儀下觀察激活卵是否形成兩原核，若形成則確定為雜合二倍體，本實(shí)驗(yàn)旨在選擇生成雜合二倍體

7、孤雌胚胎效率最佳的孤雌激活方法用于制作與雄性胚胎嵌合發(fā)育的8細(xì)胞期孤雌胚胎。結(jié)果顯示：采用含10mmol/L的Srcl2和5ug/mlCB處理4小時(shí)，激活率最高為76.7％，激活小鼠卵母細(xì)胞后形成雜合二倍體孤雌胚比例最高為39.5％，與乙醇聯(lián)合6—DMAP激活后形成雜合二倍體孤雌胚比例31.6％略高，但差異不顯著(p＞0.05)。 1.2小鼠孤雌胚胎早期發(fā)育的培養(yǎng)體系研究 小鼠卵母細(xì)胞孤雌激活之后，選取雜合二倍體胚胎，通

8、過(guò)在不同培養(yǎng)液中的培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)得到的2、4細(xì)胞和囊胚進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，旨在建立一套完善的適合雜合二倍體孤雌胚胎體外培養(yǎng)的體系，試驗(yàn)結(jié)果如下： (1)CZB和mM16能較好地過(guò)2-cell阻滯發(fā)育至囊胚，各組中2-cell胚胎發(fā)育率相近，差異不顯著，但CZB+FBS和CZB+BSA組的4—cell胚胎發(fā)育率均較相應(yīng)的mM16組高，胚胎發(fā)育速度較快；無(wú)論CZB或mM16培養(yǎng)液，添加FBS組的囊胚發(fā)育率均高于相應(yīng)添加BSA的組，而且CZB添加

9、FBS組的囊胚發(fā)育率高于其他各組，差異顯著(p＜0.05)。 (2)用CZB添加FBS組培養(yǎng)過(guò)2-cell阻滯，于培養(yǎng)到4—cell期后添加葡萄糖組的囊胚發(fā)育率稍好于未添加組，兩組的囊胚發(fā)育率都明顯高于全程添加組，且差異顯著(p＜0.05)，。 結(jié)果表明：在體外培養(yǎng)孤雌胚胎時(shí)，4—cell期之前采用CZB+1.5％FBS作為培養(yǎng)液，而當(dāng)胚胎發(fā)育至4細(xì)胞時(shí)就換用CZB+15％FBS+1.1mg/mL，Glu培養(yǎng)。

10、1.3用于性別鑒定的小鼠8—細(xì)胞期有性生殖胚胎最佳獲取時(shí)間研究 為了獲得較多的8細(xì)胞胚胎，在掌握小鼠發(fā)育規(guī)律的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在小鼠注射HCG后60、64、68h，取交配見(jiàn)栓標(biāo)記的小鼠輸卵管沖胚，統(tǒng)計(jì)小鼠胚胎發(fā)育階段，結(jié)果顯示在注射HCG后64h沖胚，得到的8細(xì)胞數(shù)最多，占總胚胎數(shù)的76.9％，與注射HCG后60h的8細(xì)胞發(fā)育率33.8％相比差異顯著(p＜0.05)，和注射HCG后68h的8細(xì)胞發(fā)育率63.6％相比差異不顯著(

11、p＞0.05)；注射HCG后68h，部分胚胎已經(jīng)發(fā)育到桑葚胚，所以在注射HCG后64～68h之間沖胚可以得到較多的8細(xì)胞期胚胎 1.4小鼠孤雌胚胎與雄性胚胎嵌合發(fā)育生成囊胚的研究 應(yīng)用雙重PCR性別鑒定技術(shù)對(duì)獲取的有性生殖8細(xì)胞胚胎進(jìn)行性別鑒定，獲得雄性8細(xì)胞胚胎后與孤雌生殖8細(xì)胞胚胎進(jìn)行嵌合培養(yǎng)，同時(shí)在相同培養(yǎng)條件下以有性生殖8細(xì)胞胚胎和孤雌胚胎的發(fā)育培養(yǎng)作為對(duì)照，觀察嵌合胚胎的發(fā)育效果，旨在研究小鼠雄性胚胎輔助與其嵌

12、合發(fā)育的孤雌胚胎的囊胚生成情況，為其后的實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)，結(jié)果顯示嵌合胚胎在體外培養(yǎng)可以發(fā)育至囊胚，其囊胚發(fā)育率為39.4％．比孤雌生殖8細(xì)胞胚胎囊胚發(fā)育率35.1％略高．差異不顯著(p＞0.05)，與有性生殖胚胎體外培養(yǎng)的囊胚率90.6％相比，差異顯著(p＜0.05)。 2、孤雌囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)離散細(xì)胞的集落生成及其不同性別來(lái)源比率研究 本研究是在本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用雙重PCR性別鑒定技術(shù)建立昆白小鼠雄性胚胎嵌合孤雌胚胎輔助發(fā)育的研究

13、模式基礎(chǔ)上，試驗(yàn)一進(jìn)一步研究了影響兩種不同類型胚胎細(xì)胞嵌合發(fā)育的幾個(gè)關(guān)鍵性問(wèn)題，以此為基礎(chǔ)，又一次應(yīng)用雙重PCR性別鑒定技術(shù)對(duì)由嵌合孤雌囊胚分離獲取的離散細(xì)胞所生成的集落進(jìn)行了性別來(lái)源標(biāo)記，統(tǒng)計(jì)分析了這種嵌合孤雌囊胚中兩種不同性別來(lái)源細(xì)胞的比率。其目的是為了提高這種新的異性胚胎嵌合培養(yǎng)輔助發(fā)育的效果和研究這種嵌合性囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中含有所需孤雌胚胎細(xì)胞的比率，為未來(lái)進(jìn)一步研究從這種嵌合的囊胚中獲取治療性孤雌胚胎干細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。 2.

14、1小鼠胎兒成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及飼養(yǎng)層的制備方法研究 本試驗(yàn)收集13.5d的小鼠胎兒，分離胎兒成纖維細(xì)胞(MEF)。分離培養(yǎng)的原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，1天后即可見(jiàn)大量細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，大多數(shù)細(xì)胞呈梭形，并可見(jiàn)少量周圍細(xì)胞呈放射狀生長(zhǎng)，也可見(jiàn)少數(shù)圓形或不規(guī)則形雜質(zhì)細(xì)胞，約3天細(xì)胞大致能長(zhǎng)滿瓶底，長(zhǎng)滿后細(xì)胞致密呈長(zhǎng)梭形。取生長(zhǎng)較好的第3代MEF用絲裂霉素處理后鋪層于明膠包被的四孔板制備飼養(yǎng)層。 2.2小鼠孤雌胚胎和雄性胚胎嵌合

15、發(fā)育囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的離散培養(yǎng)研究 本實(shí)驗(yàn)共對(duì)6枚嵌合囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行了單細(xì)胞分離，平均每個(gè)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)消化分離后可收集到11.83個(gè)單細(xì)胞，將單細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)增殖后發(fā)現(xiàn)，有5枚嵌合囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)單細(xì)胞能夠在體外增殖。平均每個(gè)嵌合囊胚可得到1.67個(gè)細(xì)胞集落。 2.3嵌合體囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)離散細(xì)胞不同性別來(lái)源比率研究 對(duì)獲得的細(xì)胞集落進(jìn)行性別鑒定檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，孤雌胚胎來(lái)源集落與雄性胚胎來(lái)源集落的比例為5：12。試驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用

16、雙引物雙重PCR性別鑒定方法可對(duì)嵌合囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中孤雌胚胎細(xì)胞來(lái)源進(jìn)行檢測(cè)。 綜上所述，小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞經(jīng)10mmol/L的Srcl2和5ug/mlCB聯(lián)合作用4h后，得到較多的雜合二倍體胚胎，于CZB+15％FBS培養(yǎng)液中培養(yǎng)，當(dāng)胚胎發(fā)育至4—cell時(shí)就換CZB+15％FBS+1.1mg/mldGlu培養(yǎng)液，培養(yǎng)到8—細(xì)胞；在小鼠超排注射HCG后64～68h，取見(jiàn)栓標(biāo)記小鼠，從輸卵管獲取8-細(xì)胞期胚胎，經(jīng)性別鑒定選擇雄性胚