海洋玫瑰桿菌類群細菌分解代謝二甲基巰基丙酸內(nèi)鹽的分子機制及動力學調(diào)控機制.pdf

1、二甲基巰基丙酸內(nèi)鹽(Dimethylsul foniopropionate，DMSP)是全球硫循環(huán)和碳循環(huán)的重要載體物質(zhì)。海洋浮游植物、大型藻類和臨海被子植物是DMSP的主要生產(chǎn)者。每年DMSP的產(chǎn)量可以達到109噸。在大洋表面的某些區(qū)域，DMSP的產(chǎn)量可以達到碳固定總量的10％。微生物介導的DMSP的分解代謝是全球硫循環(huán)和碳循環(huán)的重要步驟。海洋玫瑰桿菌類群細菌(Marine Roseobacter Clade，MRC)是分解代謝DMS

2、P的主要微生物類群之一。微生物利用胞內(nèi)DMSP裂解酶裂解DMSP產(chǎn)生二甲基硫(Dimethyl sulfide，DMS)和丙烯酸(Acrylate)。DMS具有揮發(fā)性，是連接海洋硫庫和大氣硫庫的重要媒介。同時，它也是重要的影響氣候的小分子物質(zhì)，可以通過影響地球?qū)μ栞椛涞姆瓷渎视绊懭驓夂颦h(huán)境。而丙烯酸則是重要的海洋碳源，很多微生物可以利用其作為唯一碳源生長。研究海洋細菌對DMSP的分解代謝對于更好認識全球硫循環(huán)和碳循環(huán)以及微生物代謝過

3、程對環(huán)境的影響具有重要意義。在本論文中，我們以海洋玫瑰桿菌類群細菌為研究對象，主要從DMSP裂解酶裂解DMSP的分子機制、DMSP裂解酶的進化機制、DMSP裂解產(chǎn)物丙烯酸胞內(nèi)代謝的分子機制以及DMSP分解代謝的動力學調(diào)控機制等幾個方面進行了研究。
　　1.海洋玫瑰桿菌類群細菌裂解DMSP產(chǎn)生DMS的分子機制
　　每年通過微生物的DMSP裂解酶裂解DMSP產(chǎn)生的DMS可以達到約3億噸。DMSP裂解酶種類豐富，到目前為止一共發(fā)現(xiàn)

4、了8種不同的DMSP裂解酶。但DMSP裂解酶裂解DMSP的分子機制研究較少。DddP是海洋中最豐富的DMSP裂解酶之一，主要來自于海洋玫瑰桿菌類群細菌。在本論文中，我們以來自Ruegeria lacuscaerulensis ITI_1157的DMSP裂解酶RlDddP為研究對象，研究了DddP催化DMSP裂解的分子機制。我們首先利用RT-qPCR技術和酶活檢測實驗手段驗證了RlDddP的功能。實驗結果表明RldddP基因能夠被DMSP

5、誘導上調(diào)表達，重組表達純化的RlDddP具有顯著的DMSP裂解酶活性。然后我們檢測了RlDddP的酶學性質(zhì)。RlDddP的最適pH為6.0，最適溫度為60℃，Km值為17.1±0.98 mM。鄰菲羅啉(o-phenanthroline，o-P)和2，2-聯(lián)吡啶(2，2-bipyridine)能夠顯著抑制RlDddP的活性，而典型的金屬螯合劑EDTA和EGTA則對RlDddP的活性無顯著影響。然后，我們分別解析了RlDddP結合底物類似物

6、嗎啉乙磺酸(MES)，RlDddP結合產(chǎn)物類似物磷酸根，RlDddP突變體Y366A結合產(chǎn)物丙烯酸，RlDddP突變體D377A結合產(chǎn)物丙烯酸的晶體結構。RlDddP在溶液中以二體形式存在。RlDddP單體有兩個結構域，兩個結構域之間的夾角約90°，是典型的“pitta-bread”結構。每個RlDddP二體含有兩個催化中心，每個催化中心螯合兩個Fe3+作為金屬離子輔基，并有10個保守的氨基酸。其中377位的天冬氨酸位于DMSP的β-C

7、附近，很可能是催化過程中的親核攻擊堿。突變驗證結果表明突變377位的天冬氨酸會導致RlDddP酶活的喪失，驗證了該氨基酸為攻擊堿的推斷。接著，我們對已解析的四個結構進行了疊合分析，發(fā)現(xiàn)RlDddP的二鐵離子輔基中的一個Fe3+在催化過程中存在“ion-shift”現(xiàn)象。Fe3+的移動有助于DMSP的結合并且增加了DMSP的α-H的酸性，是RlDddP實現(xiàn)催化功能的關鍵一步。最后，在綜合實驗結果的基礎上，我們提出了RlDddP裂解DMSP

8、的分子機制。本研究對更好的認識微生物裂解DMSP產(chǎn)生丙烯酸釋放DMS的過程具有重要意義。
　　2.M24金屬蛋白酶來源的DMSP裂解酶DddP的進化機制
　　序列和基因組分析認為DMSP代謝是在其它已存在的代謝途徑的基礎上進化產(chǎn)生的。DMSP裂解酶種類豐富，已發(fā)現(xiàn)的DMSP裂解酶分屬于不同的家族。DMSP裂解酶的多樣性暗示著DMSP裂解酶可能具有不同的進化來源。在本論文中，我們以來源于R.lacuscaerulensis I

9、TI1157的RlDddP為例，研究了DddP從金屬蛋白酶進化為DMSP裂解酶的機制。因為序列分析顯示DddP屬于M24金屬蛋白酶家族，所以我們首先利用RT-qPCR技術和酶活檢測實驗手段檢測了RlDddP的蛋白酶功能。研究發(fā)現(xiàn)RldddP基因不能被短肽和酪蛋白誘導，重組表達純化的RlDddP也檢測不到蛋白酶活性，說明RlDddP從金屬蛋白酶進化為DMSP裂解酶后完全喪失了蛋白酶功能。然后，我們分別對DddP的蛋白全長及N端結構域進行了

10、系統(tǒng)發(fā)生分析。研究發(fā)現(xiàn)，DddP在M24金屬蛋白酶家族中形成了一個獨立的分支，而且擁有一個不同于其他M24金屬蛋白酶的全新的N端結構域。結構分析結果顯示全新的N端結構域使得RlDddP形成了一個緊密的二體結構，從而使得RlDddP的底物入口僅能允許DMSP進入而不允許短肽進入。接著，我們對RlDddP與M24金屬蛋白酶極為相似的C端結構域進行了結構疊合分析。結果顯示在金屬蛋白酶中起穩(wěn)定反應中間態(tài)作用的氨基酸突變成了DMSP裂解酶中的關鍵

11、的催化堿。催化中心關鍵氨基酸的突變導致了RlDddP蛋白酶催化能力的喪失和DMSP裂解酶催化能力的形成。最后，在綜合N端結構域和C端結構域研究結果的基礎上，我們提出了DddP從金屬蛋白酶進化為DMSP裂解酶的機制。這一研究有助于更好地認識DMSP裂解酶的進化機制。
　　3.海洋玫瑰桿菌類群細菌胞內(nèi)代謝丙烯酸的分子機制
　　丙烯酸是重要的海洋微生物碳源，同時丙烯酸及其代謝產(chǎn)物丙烯酰輔酶A具有很高的細胞毒性，丙烯酸需要在胞內(nèi)實現(xiàn)

12、快速代謝從而避免對微生物的生存造成影響。但是到目前為止，丙烯酸代謝的分子機制尚不清楚。在本論文中，我們以代謝DMSP的主要類群海洋玫瑰桿菌類群細菌為研究對象，研究了DMSP代謝菌株胞內(nèi)代謝丙烯酸的分子機制。首先，我們驗證了該類群胞內(nèi)代謝丙烯酸的代謝途徑。研究發(fā)現(xiàn)，該類群主要通過以丙酸輔酶A連接酶(PrpE)和烯酰輔酶A還原酶(AcuI)為關鍵酶的PrpE-AcuI途徑實現(xiàn)丙烯酸的代謝。然后，我們分別解析了Dinoroseobacter

13、shibae DFL12的PrpE和R.pomeroyi DSS-3的AcuI的結構。PrpE在溶液中以單體形式存在。它的拓撲結構與同家族的其它?；o酶A連接酶相似，擁有兩個結構域，一個N端結構域和一個C端結構域。AcuI則在溶液中以二體形式存在。它的拓撲結構與來自大腸桿菌的YhdH相似，擁有一個典型的rossmann折疊結構用以結合輔酶NADPH。接著，我們分別研究了PrpE和AcuI催化中心保守的氨基酸的功能。PrpE具有兩個構象，

14、即腺苷酸形成構象和硫酯形成構象。PrpE高度保守的588位的賴氨酸和502位的甘氨酸分別位于兩個構象的活性中心，且突變會導致PrpE的酶活喪失。因此，PrpE588位的賴氨酸很可能是PrpE催化腺苷酸形成半反應的關鍵氨基酸，而502位的甘氨酸則很可能是硫酯形成半反應中的關鍵氨基酸。AcuI的催化中心結合一個NADPH輔基。NADPH煙酰胺基團附近的親水氨基酸中僅有323位的精氨酸突變會顯著影響AcuI的酶活。因此，323位的精氨酸很可能

15、是AcuI催化過程中接受電子的廣義酸，而NADPH則很可能在AcuI的催化過程中提供反應的還原力。最后，綜合實驗結果，我們提出了PrpE和AcuI共同參與胞內(nèi)代謝丙烯酸的分子機制。本研究對更好的認識微生物的胞內(nèi)丙烯酸代謝具有重要意義。
　　4.海洋玫瑰桿菌類群細菌分解DMSP的動力學調(diào)控機制
　　DMSP在細菌胞內(nèi)的分解代謝是一個復雜的過程，涉及到多步反應，需要多種酶分工合作，相互協(xié)調(diào)。DMSP除了作為重要的硫循環(huán)和碳循環(huán)的

16、載體物質(zhì)之外，還具有重要的生理功能。DMSP代謝菌株往往會在胞內(nèi)積累DMSP作為滲透壓保護劑、抗氧化劑或防凍劑。DMSP在胞內(nèi)的濃度可以達到毫摩爾量級，而DMSP裂解過程的產(chǎn)物丙烯酸，尤其是丙烯酰輔酶A，具有很強的胞內(nèi)毒性，需要快速代謝。因此，DMSP分解代謝需要一個調(diào)控機制來維持胞內(nèi)的DMSP濃度并保證丙烯酸，尤其是丙烯酰輔酶A，的快速代謝。而到目前為止，尚沒有文獻涉及DMSP分解代謝的調(diào)控。在本論文中，我們以代謝DMSP的主要類群海

17、洋玫瑰桿菌類群細菌為研究對象，研究了DMSP裂解過程的動力學調(diào)控機制。首先，我們研究了已報道的多種DMSP裂解酶、丙烯酸代謝相關酶PrpE和AcuI的Km值。研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)的胞內(nèi)DMSP裂解酶的Km值＞PrpE的Km值＞＞AcuI的Km值。而后，我們比較了多種DMSP裂解酶，丙烯酸代謝相關酶PrpE和AcuI的kcat/Km值。結果表明，絕大多數(shù)的DMSP裂解酶的kcat/Km值＞PrpE的kcat/Km值＞＞AcuI的kcat/Km

18、值。在此基礎上，我們提出了DMSP裂解過程的動力學調(diào)控機制，即DMSP裂解酶、PrpE和AcuI底物結合能力和催化效率的不同保證了DMSP的胞內(nèi)積累和其代謝產(chǎn)物丙烯酸，尤其是丙烯酰輔酶A的快速代謝。接著，我們通過研究PrpE和AcuI在自然界的豐度發(fā)現(xiàn)PrpE和AcuI不僅在海洋玫瑰桿菌類群細菌中存在，在不同生境不同生物域的生物中均有分布。而且，除DMSP分解代謝外，多種代謝——如DMSP去甲基化代謝、乳酸代謝、丙酸代謝、β-丙氨酸和葡

19、萄糖代謝——都可以產(chǎn)生丙烯酸和丙烯酰輔酶A。因此，DMSP裂解過程的動力學調(diào)控機制不僅對來自海洋的玫瑰桿菌類群細菌的DMSP分解代謝具有意義，同時具有擴展到其它生境的其它生物的其它代謝過程中的潛力，具有較為廣泛的意義。
　　本論文對海洋玫瑰桿菌類群DMSP裂解酶裂解DMSP的分子機制、DMSP裂解酶的進化機制、DMSP裂解產(chǎn)物丙烯酸胞內(nèi)代謝的分子機制及DMS分解代謝的動力學調(diào)控機制進行了較為深入的研究，研究結果有助于我們更好的認識