谷胱甘肽發(fā)酵代謝調(diào)控及動力學(xué)的研究.pdf

1、谷胱甘肽(L-Glutathione,簡稱GSH),化學(xué)名:γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸-甘氨酸(γ-L-glutamyl-L-cysteinyl-glycine),是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸縮合而成的三肽化合物。GSH是一種廣泛存在于動、植物和微生物細(xì)胞中的具有重要生理活性的活性三肽,在蛋白質(zhì)和DNA的合成、物質(zhì)的運輸、酶的活性、新陳代謝及細(xì)胞的保護等方面具有直接或間接作用。GSH主要在醫(yī)藥和食品兩大領(lǐng)域具有廣泛用途。GSH的生產(chǎn)方

2、法主要有溶劑萃取法、化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法和發(fā)酵法。目前國內(nèi)關(guān)于GSH的研究主要集中在菌種選育、培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化、分離提取和在臨床應(yīng)用上,而關(guān)于發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的代謝調(diào)控和動力學(xué)研究則較少。
　　 (1)研究了在不同發(fā)酵階段添加不同濃度的前體氨基酸對釀酒酵母YF(ZnCl2r,Ethr)發(fā)酵生產(chǎn)GSH的影響。結(jié)果表明分別添加低濃度(2mmol/L左右)的L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸三種前體氨基酸對釀酒酵母突變株YF的細(xì)胞生

3、長都會有促進作用,但濃度大于4mmol/L時則呈現(xiàn)抑制作用。L-半胱氨酸對釀酒酵母突變株YF發(fā)酵生產(chǎn)GSH影響最大,L-谷氨酸影響次之,甘氨酸影響最小。經(jīng)正交實驗優(yōu)化后,添加混合前體氨基酸可以顯著提高谷胱甘肽濃度。
　　 (2)研究了非前體氨基酸對釀酒酵母YF(ZnCl2r,Ethr)發(fā)酵生產(chǎn)GSH的影響。結(jié)果表明在穩(wěn)定期添加3mmol/L的非前體氨基酸,對釀酒酵母突變株YF的細(xì)胞干重基本無影響。除L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-賴

4、氨酸、L-丙氨酸和L-甲硫氨酸這五種氨基酸可以促進谷胱甘肽合成外,其它氨基酸對谷胱甘肽合成無顯著影響。在發(fā)酵22h添加L-甲硫氨酸5mmol/L時可以使谷胱甘肽濃度達到142.68mg/L,比空白對照增大了66.8％。
　　 (3)通過破碎酵母細(xì)胞后向反應(yīng)液中加入前體氨基酸和ATP的方法,研究抑制谷胱甘肽合成相關(guān)酶活性的因素。結(jié)果顯示:谷胱甘肽濃度在13mmol/L以上時,谷胱甘肽對GSHⅠ抑制作用明顯。同時ADP與ATP的比對

5、GSHⅠ和GSHⅡ兩種酶都有影響,趨勢為ADP與ATP的比越大,對GSHⅠ和GSHⅡ的抑制作用越大。
　　 (4)使用Design Expert軟件的Plackett-Burman設(shè)計法篩選出了影響5L發(fā)酵罐中谷胱甘肽生物合成的三個主要因素,響應(yīng)面分析法表明這三個因素最佳水平值為:攪拌轉(zhuǎn)速187r/min,通氣量246L/h,pH值6.36。利用Originpro8.0軟件對分批發(fā)酵的菌體干重、谷胱甘肽濃度和發(fā)酵液中糖濃度實驗值

6、進行擬合,得到細(xì)胞生長動力學(xué)模型、產(chǎn)物生成動力學(xué)模型和基質(zhì)消耗動力學(xué)模型。模型分析和實驗驗證結(jié)果表明該模型擬合效果好,具有較高的穩(wěn)定性。
　　 (5)研究了5L發(fā)酵罐中分批補加葡萄糖生產(chǎn)GSH的條件,結(jié)果表明補料分批發(fā)酵至33h時GSH濃度達到72.49mg/L,細(xì)胞干重達到28.52g/L,分別為初糖20g/L分批培養(yǎng)方式的2.86倍和4.93倍。構(gòu)建了補料分批發(fā)酵階段細(xì)胞生長動力學(xué)模型、產(chǎn)物生成動力學(xué)模型和基質(zhì)消耗動力學(xué)模型