淫羊藿苷體內處置及代謝動力學研究.pdf

1、目的： 1.考察淫羊藿苷人工胃腸液及腸道菌群中的穩(wěn)定性。 2.建立靈敏度高、專屬性強、方便可行的HPLC-MS/MS分析方法，測定生物樣品中淫羊藿苷及其代謝產(chǎn)物淫羊藿次苷Ⅱ的濃度。 3.進行中國健康志愿者單次口服XX膠囊（淫羊藿總黃酮提取物）后淫羊藿苷及其代謝物淫羊藿次苷Ⅱ的藥代動力學研究。 4.進行大鼠灌胃淫羊藿苷單體及XX膠囊的藥動學差異比較研究。 5.采用Caco-2細胞培養(yǎng)淫羊藿苷考察其是

2、否被小腸細胞代謝，闡明其生物利用度低的原因。 方法： 1.采用HPLC-UV法研究淫羊藿苷在人工胃腸液中的穩(wěn)定性。以乙腈：0.1％甲酸（30：70，VN）為流動相，采用Agilent Extend C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱分離，DAD檢測器，波長274nm，流速1mL·min-1，進樣量20μL。 2.血漿經(jīng)經(jīng)乙酸乙酯提取、吹干、復溶后，以0.1％甲酸-乙腈（30：70，V/V）為流動相，采

3、用AGT Venusil XBP-C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱分離，流速1.0mL·min-1，柱溫30℃，進樣量20μL； ESI源，正離子模式，霧化壓力為40 psi，干燥氣（N2）流速為9 L·min-1，干燥氣溫度為350℃，毛細管電壓4000V。多級反應監(jiān)測（MRM）方式，m/z 677.1→369.0（淫羊藿苷），m/z 515.1→369.1（淫羊藿次苷Ⅱ），m/z321.0→275.0（內標），掃描間隔

4、為200ms。淫羊藿苷碰撞能量為28eV，碎片電壓為135V，淫羊藿次苷Ⅱ碰撞能量為8eV，碎片電壓為100V，內標碰撞能量為20eV，碎片電壓為135V，電子倍增器電壓為800V。 3.8名健康志愿者，男女各半，單次口服15粒XX膠囊，留取血樣采用。HPLC-MS/MS法檢測血漿中淫羊藿苷及淫羊藿次苷Ⅱ的濃度，采用DAS2.0實用藥代動力學程序進行模型擬合并計算其藥代動力學參數(shù)。 4.16只大鼠隨機分為兩組，分別灌胃給

5、予相同劑量的淫羊藿苷單體及XX膠囊內容物（以淫羊藿苷計），留取血漿樣本，采用HPLC-MS/MS法檢測淫羊藿苷及淫羊藿次苷Ⅱ藥物濃度，采用非房室模型藥代動力學程序PKSolver計算藥代動力學參數(shù)，評價淫羊藿苷單體及XX膠囊內容物大鼠藥代動力學差異。 5.將淫羊藿苷與Caco-2細胞共同孵育，收集基底側樣本，測定淫羊藿苷及其代謝物濃度。 結果： 1.淫羊藿苷在37℃人工胃液中孵育2小時后，仍有90％以上的原形藥物

6、。但在人工腸液中孵育12h后，淫羊藿苷減少至80％，表明淫羊藿苷在人工腸液中可被破壞分解。進一步采用HPLC-MS/MS法觀察淫羊藿苷在人體腸道菌群的穩(wěn)定性。結果發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷極易被腸道菌群水解，孵育1h后，淫羊藿苷幾乎被水解完全，而水解產(chǎn)物淫羊藿次苷Ⅱ也易被腸道菌群進一步水解，產(chǎn)生淫羊藿素，同時發(fā)現(xiàn)疑似C6-異戊烯基異構化的淫羊藿素。通過比較人、大鼠腸道菌群對淫羊藿苷及淫羊藿次苷Ⅱ的代謝過程可知，二者較為相似，但大鼠腸菌對淫羊藿次苷Ⅱ

7、的降解速度較為緩慢，且生成的淫羊藿素的量相對較少。 2.HPLC-MS/MS法測定人血漿中淫羊藿苷及淫羊藿次苷Ⅱ濃度，淫羊藿苷及淫羊藿次苷Ⅱ在0.05～10ng·mL-1濃度范圍內線性關系良好，回歸方程分別為Y=0.2766X+0.0197，（r=0.99302），Y=0.4331X+0.0824，（r=0.99357）。最低定量限均為0.05 ng·mL-1，絕對回收率分別大于65％和55％，相對回收率范圍為85％-120％，

8、批內變異均小于10％，批間變異均小于15％，淫羊藿苷與淫羊藿次苷Ⅱ血漿中冷凍及反復凍融條件下穩(wěn)定。 3.健康志愿者單次口服15粒XX膠囊后，血漿中檢測到淫羊藿次苷Ⅱ及微量淫羊藿苷。淫羊藿次苷Ⅱ在健康志愿者體內的藥代動力學過程符合權重系數(shù)為1/c的一室模型，其主要藥代動力學參數(shù)：t1/2為（8.954±3.424）h， AUC0-12為（9.642±4.520）ng·mL-1·h， AUC0～∞為（12.884±6.750）ng·

9、mL-1·h。男女健康志愿者各藥代動力學參數(shù)經(jīng)雙側t檢驗顯示無統(tǒng)計學意義，提示淫羊藿次苷Ⅱ體內藥代動力學行為不存在性別差異。 4.大鼠灌胃相同劑量（50mg/kg，以淫羊藿苷計）淫羊藿苷單體及XX膠囊內容物后淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ的藥時曲線出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，單體組大鼠血漿淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ的濃度均高于XX膠囊組。用非房室模型計算藥動學參數(shù)，灌胃給予淫羊藿苷單體及XX膠囊內容物后淫羊藿苷的主要藥動學參數(shù)分別為t1/2（3.612±

10、1.067）h和（6.022±3.381）h，Tmax（0.958±0.668）h和（1.219±1.129）h， Cmax（21.037±9.090）ng·mL-1和（14.904±4.492）ng·mL-1，AUC0-12（78.488±42.653）ng·mL-1·h和（42.532±13.839）ng·mL-1·h， AUC0～∞（87.054±45.391）ng·mL-1·h和（51.214±13.043）ng·mL-1，h。

11、淫羊藿次苷Ⅱ的主要藥動學參數(shù)分別為t1/2（3.014±1.358）h和（17.171±10.170）h，Tmax（3.938±2.275）h和（0.938±0.477）h， Cmax（20.943±8.583）ng·mL-1和（5.448±2.381）ng·mL-1， AUC0-12（87.101±24.814）ng·mL-1·h和（18.822±10.160）ng·mL-1·h，AUC0～∞（96.295±22.934）ng·mL-

12、1·h和（35.161±8.405）ng·mL-1·h。灌胃淫羊藿苷單體后，淫羊藿次苷Ⅱ的達峰時間與淫羊藿苷相比明顯延后，峰濃度和AUC均有明顯降低。這也印證了第一部分的結論，淫羊藿苷在腸道菌群的作用下水解為淫羊藿次苷Ⅱ，因而淫羊藿次苷Ⅱ的達峰時間較為靠后；淫羊藿苷除水解為淫羊藿次苷Ⅱ外，還能進一步水解為淫羊藿素，故淫羊藿次苷Ⅱ的峰濃度較低。但在所有大鼠的血漿中均未檢測到淫羊藿素，這可能與淫羊藿素在小腸上皮細胞吸收較差有關。灌胃給予淫羊

13、藿苷單體后，淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ的峰濃度、AUC均高于灌胃XX膠囊內容物，由此可以充分說明，XX膠囊這種黃酮苷混合物的給藥方式不利于淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ的吸收。對灌胃淫羊藿苷單體和XX膠囊內容物后淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ主要藥動學參數(shù)進行統(tǒng)計學分析，結果表明淫羊藿苷除AUC0-12和AUC0～∞具有統(tǒng)計學意義外，其余參數(shù)均無統(tǒng)計學意義，而淫羊藿次苷Ⅱ主要藥動學參數(shù)均具有統(tǒng)計學意義。 5.10μg·mL-1淫羊藿苷Caco-2細

14、胞孵育試驗結果表明，淫羊藿苷可被Caco-2細胞內的酶系代謝分解為淫羊藿次苷Ⅱ和淫羊藿素的異構體。 結論： 1.淫羊藿苷在胃內相對穩(wěn)定，在人工腸液中孵育12小時尚有80％原形存在，但在腸道菌群的作用下可被迅速分解為淫羊藿次苷Ⅱ，并進一步分解為淫羊藿素。 2.健康志愿者口服XX膠囊后檢測到淫羊藿次苷Ⅱ和微量的淫羊藿苷，男女志愿者之間藥動學參數(shù)無統(tǒng)計學差異。 3.大鼠灌胃淫羊藿苷單體和XX膠囊內容物后，單體組