健康人群組織蛋白酶B與衰老相關(guān)心腎亞臨床狀態(tài)改變的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：衰老是一個(gè)復(fù)雜的并受基因、環(huán)境等多因素相互作用影響的過(guò)程。其中細(xì)胞向衰老表型進(jìn)展是衰老相關(guān)病理過(guò)程的基礎(chǔ)。細(xì)胞隨增齡呈現(xiàn)一系列結(jié)構(gòu)和功能改變，其中衰老細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的改變可導(dǎo)致溶酶體膜穩(wěn)定性降低，通透性增高，引起大量溶酶體水解酶釋放到胞漿或組織間隙并被激活，參與衰老相關(guān)多種疾病的發(fā)病過(guò)程。組織蛋白酶B(Cathepsin B，CTSB)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種與衰老及多種疾病病理過(guò)程密切相關(guān)的溶酶體蛋白水解酶。CTSB在生理狀態(tài)下，參與抗原

2、提呈，組織器官發(fā)育等許多生理過(guò)程，在病理狀態(tài)下，各種原因所致細(xì)胞損傷，如衰老、氧化應(yīng)激、炎癥因子等，導(dǎo)致溶酶體膜穩(wěn)定性降低，大量CTSB釋放到胞漿及組織間隙并被激活，參與細(xì)胞炎癥反應(yīng)及凋亡、自噬的發(fā)生，與許多疾病如腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，動(dòng)脈粥樣硬化，糖尿病腎病及其它急慢性炎癥性疾病有關(guān)，因此備受關(guān)注。并且近年研究發(fā)現(xiàn)CTSB隨年齡的增加其血清中活性增強(qiáng)，其與衰老的相關(guān)性日益受到重視，而目前尚缺乏關(guān)于CTSB與衰老有關(guān)的亞臨床

3、狀態(tài)改變的相關(guān)性研究。心腎相關(guān)疾病是老年人健康的主要威脅者，心腎交互作用是老年共病的可能機(jī)制，也是老年醫(yī)學(xué)面臨的重要挑戰(zhàn)。本研究旨在探討健康人群CTSB水平與衰老相關(guān)的心腎亞臨床狀態(tài)改變的相關(guān)性問(wèn)題，探索參與衰老相關(guān)心腎功能障礙的細(xì)胞分子基礎(chǔ)。
　　方法：⑴選取2011年沈陽(yáng)各社區(qū)的健康人群，入選基于健康的體檢報(bào)告或臨床檢查結(jié)果，入選標(biāo)準(zhǔn)包括:30歲以上的健康男性或女性，無(wú)精神障礙，心理健康，具有自理能力和一定的社會(huì)交往能力和適應(yīng)

4、能力，排除高血壓、糖尿病、冠心病及其它急慢性疾病者。共有440人被招募，經(jīng)過(guò)血液生化、肺功能、心電圖等檢查，排除檢查結(jié)果異常的71名個(gè)體，最終有369人（155名男性，214名女性）被選入研究。該研究通過(guò)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)倫理批準(zhǔn)，研究對(duì)象均簽署知情同意書。2014年對(duì)2011年選取的369名健康人群進(jìn)行隨訪，排除終點(diǎn)事件（8例）、缺失隨訪（152例）或數(shù)據(jù)丟失（14例）的174人，最終，195人被確定為該縱向研究的樣本人群（77名男性，11

5、8名女性，年齡36-87歲）。終點(diǎn)事件包括心血管復(fù)合終點(diǎn)事件、心肌梗死、中風(fēng)，充血性心力衰竭、腎衰竭或死亡。研究對(duì)象均簽署知情同意書。⑵收集研究對(duì)象的基礎(chǔ)資料，如年齡、性別、身高、體重。靜息10分鐘后測(cè)量血壓?？崭?2小時(shí)后采靜脈血，部分血樣用于常規(guī)生化檢測(cè)包括空腹血糖、血肌酐、甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇。其余血樣采集后迅速離心、分裝、凍存(-80℃)。根據(jù)CKD-EPI公式計(jì)算腎小球率過(guò)濾。⑶應(yīng)用酶聯(lián)免

6、疫吸附試驗(yàn)Elisa法檢測(cè)血清中CTSB等特殊指標(biāo)水平。所應(yīng)用試劑盒是通過(guò)雙抗體夾心ELISA法定量測(cè)定人血清中CTSB含量。所用試劑盒具有較高的特異性和精密度。分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔、空白孔。向微孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本，其中的CTSB與連接于固相載體上的抗體結(jié)合，然后加入生物素化的CTSB抗體，將未結(jié)合的生物素化抗體洗凈后，加入HRP標(biāo)記的親和素，再次徹底洗滌后加入TMB底物顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色，并在酸的作用

7、下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的CTSB呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（O.D.值），計(jì)算樣品濃度。⑷研究對(duì)象均接受二維彩色多普勒超聲心動(dòng)圖檢查，患者取左側(cè)臥位，采用雙平面改良Simpson's法測(cè)量左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)，使用脈沖式多普勒，于心尖四腔切面二尖瓣瓣尖水平檢測(cè)心室充盈早期血流速度（二尖瓣E峰值）和心室充盈晚期血流速度（二尖瓣A峰值），并計(jì)算E/A比值。⑸采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)

8、據(jù)用(x)±s表示，組間比較采用單向方差分析(one-way ANOVA)，根據(jù)方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果選擇應(yīng)用LSD法或Dunnett's T3進(jìn)行各組均數(shù)的多重比較。雙變量相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)，并用多元線性回歸分析控制混雜因素的影響。分類資料的組間比較應(yīng)用卡方檢驗(yàn)及Fisher確切概率法，相關(guān)分析采用Pearson列聯(lián)系數(shù)，應(yīng)用多元Logistic回歸分析控制混雜因素的影響，p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：①

9、在橫斷面研究中，證實(shí)心腎功能隨著年齡增長(zhǎng)而逐漸減退并具有性別差異性。發(fā)現(xiàn)CTSB隨增齡其血清濃度增加(p＜0.05)，男性血清CTSB水平明顯高于女性。CTSB水平與女性心臟舒張功能和腎功能明顯相關(guān)，在調(diào)整混雜變量后，CTSB與女性SCr、eGFR的顯著相關(guān)性仍然存在。②在縱向研究中，血清CTSB基線水平在不同心臟舒張功能組間存在差異(p＜0.05）。在總體中，血清CTSB水平與心臟舒張功能相關(guān)。高血清CTSB濃度組發(fā)生心臟舒張功能不全

10、的風(fēng)險(xiǎn)性明顯高于低濃度組(OR=2.542，P＜0.05)。然而，在調(diào)整年齡混雜變量后，該相關(guān)性消失。高血清CTSB濃度組發(fā)生心臟舒張功能改善的概率高于中等濃度組(OR=0.209，P＜0.05)。在調(diào)整所有混雜變量后，該相關(guān)性仍然存在?；€期血清肌酐隨CTSB濃度的增高而增高，eGFR隨CTSB濃度的增高而降低(p＜0.05）。然而，這種相關(guān)性在卡方檢驗(yàn)和Logistic回歸分析中未被進(jìn)一步證實(shí)。
　　結(jié)論：⑴血清CTSB水平與

11、健康人群衰老相關(guān)心腎亞臨床改變有關(guān)，其中CTSB對(duì)女性腎臟功能具有獨(dú)立相關(guān)性，CTSB參與衰老病理生理過(guò)程中與其它細(xì)胞因子和分子存在相互關(guān)系，衰老是受多種細(xì)胞因子及分子綜合作用和調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，血清CTSB或聯(lián)合PTH等其它指標(biāo)的測(cè)定可對(duì)健康人群尤其是老年女性腎臟功能的預(yù)測(cè)提供有價(jià)值的參考依據(jù)，這些研究也有助于對(duì)衰老及相關(guān)心腎功能障礙的細(xì)胞分子機(jī)制的理解。⑵在縱向研究中，我們進(jìn)一步分析了健康人群血清CTSB與衰老相關(guān)心腎功能縱向改變的相