兩種小麥葉片衰老相關(guān)絲氨酸蛋白酶的純化與其生化特性鑒定.pdf

1、本研究在小麥衰老葉片中發(fā)現(xiàn)了兩種性質(zhì)類似的絲氨酸蛋白酶S1和S2，我們研究分析了它們的生化特性，并對(duì)它們進(jìn)行了分離純化及質(zhì)譜鑒定，根據(jù)結(jié)果確定該兩個(gè)蛋白酶都來(lái)源于TaSSP1(Triticum aestivum Subtilisin-like Serine Protease1)，接著還對(duì)它的生理功能做了進(jìn)一步的研究分析。本論文的具體研究工作及其結(jié)果闡述如下:
　　1、小麥葉片中兩種衰老相關(guān)蛋白酶的初步鑒定
　　首先利用含明膠

2、的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(gelatin-SDS-PAGE)的方法，在衰老小麥葉片中發(fā)現(xiàn)了兩種和葉片衰老相關(guān)的蛋白酶S1和S2。然后用小麥衰老葉片粗酶液對(duì)它們的生化特性做了初步的分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)蛋白酶活性隨著暗誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸上升，在72 h時(shí)其活性達(dá)到最大。研究結(jié)果還顯示，兩個(gè)蛋白酶在30-70℃范圍內(nèi)能保持其較高的活性，最適反應(yīng)溫度約在60℃;兩種蛋白酶的最適pH大約在8.0左右，在pH6.0-9.0間蛋白酶的活性

3、都較高;兩種蛋白酶在4-60℃水浴環(huán)境中具有較高的穩(wěn)定性，但高于70℃該酶的活性基本喪失。此外，蛋白酶S1和蛋白酶S2的活性都能被絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF和AEBSF完全抑制，三種金屬蛋白酶抑制劑EDTA，EGTA和1，10-phenanthroline能部分抑制其活性，上述結(jié)果表明蛋白酶S1和S2可能是依賴金屬離子的絲氨酸類蛋白酶。
　　2、蛋白酶的分離純化與質(zhì)譜鑒定
　　采用暗誘導(dǎo)72 h的小麥葉片作為材料，葉片粗酶液

4、依次通過(guò)熱變性處理，硫酸銨沉淀，凝膠層析脫鹽，離子交換層析，蛋白濃縮和切膠回收等方法對(duì)上述兩個(gè)蛋白酶S1和S2進(jìn)行了分離與純化。結(jié)果如下:葉片粗酶液在50℃環(huán)境中保溫30 min，能夠去除一些熱不穩(wěn)定的蛋白;在硫酸銨沉淀中，蛋白酶S1和S2主要在60％-70％的硫酸銨濃度中沉淀下來(lái)，蛋白酶S2在50％-60％有少許沉降，而蛋白酶S1在70％-80％有少許沉降;在對(duì)收集有活性的樣液進(jìn)行Q-sepharose離子交換層析中，兩個(gè)蛋白酶主要在

5、0.3-0.4 mol/L鹽濃度范圍內(nèi)被洗脫下來(lái)，且蛋白酶S1先被洗脫下來(lái)，蛋白酶S2隨后洗脫下來(lái)，接著將有活性的目的樣品收集濃縮。在檢測(cè)每步純化步驟的蛋白酶活性變化時(shí)，結(jié)果顯示隨著純化步驟的進(jìn)行，在SDS-PAGE中能夠明顯看到目的條帶，通過(guò)銀染和活性染色的結(jié)果比較分析，分別確定了S1和S2兩個(gè)目的蛋白酶的條帶Ⅰ和Ⅱ（圖2.4）;根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳算出蛋白酶S1和S2分子量分別為77.9 kDa和70.2 kDa左右;將凝膠上通過(guò)

6、切膠回收的兩條可能目的蛋白條帶樣品送到北京軍事醫(yī)院科學(xué)研究院蛋白質(zhì)組研究中心進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，質(zhì)譜的結(jié)果顯示兩個(gè)蛋白酶S1和S2來(lái)自于同一蛋白酶TaSSP1。
　　3、蛋白酶S1和S2的生化特性和其體內(nèi)生理功能分析鑒定
　　我們采用純化后的蛋白酶樣品做進(jìn)一步的研究，其生化特性結(jié)果與上述結(jié)果相似，也和TaSSP1的性質(zhì)相似。具體結(jié)果如下:蛋白酶S1和S2的最適溫度在50-60℃之間，最適pH在8.0左右，在60℃時(shí)能保持其較高的穩(wěn)

7、定性，能夠完全被絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF和AEBSF所抑制，金屬蛋白酶抑制劑能部分抑制蛋白酶S1和S2的活性。在金屬離子對(duì)蛋白酶活性影響的研究中，我們發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)蛋白酶廣泛受到二價(jià)金屬離子（Ca2+，Mn2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，Mg2+，F(xiàn)e2+）的激活作用，另外Al3+對(duì)蛋白酶S1和S2的活性也有一定的促進(jìn)作用，但是一價(jià)金屬離子對(duì)兩個(gè)蛋白酶活性沒(méi)有什么影響。在0.2-10 mM的SDS對(duì)蛋白酶的影響研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)SDS濃

8、度超過(guò)0.6 mM后，兩個(gè)蛋白酶的活性都受到激活。利用本實(shí)驗(yàn)室制備的TaSSP1多克隆抗體，western-blot結(jié)果顯示在70 kDa左右位置處有明顯的蛋白印記，其位置和gelatin-SDS-PAGE的結(jié)果一致，即位置都在70 kDa左右。最后進(jìn)一步對(duì)蛋白酶S1和S2在小麥體內(nèi)的生理功能做了初步研究，主要利用western-blot對(duì)蛋白酶S1和S2在不同非生物逆境和不同激素處理中的表達(dá)量做了分析。結(jié)果顯示，蛋白酶S1和S2在干旱