小麥葉片中一種與Rubisco大亞基降解相關的蛋白酶的生化特性研究.pdf

1、在前期研究中發(fā)現了小麥葉片中一種能夠降解1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)大亞基的蛋白酶緊密結合于Rubisco的基礎上，本文以小麥3E158(Triticumaestivum L.cv.3E158)葉片為實驗材料，通過天然梯度凝膠電泳后切膠回收得到的Rubisco，應用SDS-PAGE分離鑒定蛋白質方法，主要研究了結合于Rubisco上的該蛋白酶在Tris-HCI和其他緩沖介質體系中降解Rubisco大亞基的生化特性

2、，并建立了以人工合成底物(Boc-LRR-AMC)快速測定該蛋白酶活性的熒光檢測方法。其主要研究結果簡述如下：
　　 1.在Tris-HCI緩沖液中電泳后切膠回收的Rubisco的大亞基降解
　　 小麥粗酶提取液經過天然梯度(5％-10％)凝膠電泳后，通過切膠回收含有Rubisco的凝膠我們得到了純度很高的Rubisco全酶。將這種Rubisco全酶在Tris-HCl緩沖液中40℃下保溫處理1h后，就能發(fā)現產生了Rubi

3、sco大亞基的降解片段；當保溫時間達到6h左右，至少可以觀察到4條清晰的降解蛋白條帶，其中包括有Zhang等(2007)在小麥暗誘導葉片粗酶提取液和葉綠體裂解液中發(fā)現的51 kDa降解片段；而這種Rubisco大亞基的降解現象可以通過預先對切膠回收得到的Rubisco煮沸3分鐘后消除。因此，我們確認在切膠回收得到的Rubisco中存在一種能將Rubisco大亞基降解成數條不同大小片段的蛋白酶，而且該蛋白酶緊密結合于Rubisco全酶中。

4、研究還發(fā)現，這種蛋白酶在10-45℃內都具有酶活性，在30℃以上時隨著溫度的升高，該酶活性逐漸增強，最適溫度在40℃左右，60℃時該蛋白酶仍可以將Rubisco大亞基降解。不同蛋白酶抑制劑對該蛋白酶的影響研究結果表明，絲氨酸型蛋白酶抑制劑AEBSF和胰蛋白酶抑制劑能夠顯著抑制該蛋白酶的活性，而PMSF和幾種金屬蛋白酶抑制劑能部分抑制該蛋白酶的活性，因此，該蛋白酶是一種需要金屬離子的絲氨酸型蛋白酶。
　　 2.在其他緩沖介質體系中

5、電泳后切膠回收的Rubisco的大亞基降解
　　 切膠回收的Rubisco在四種緩沖介質體系中的大亞基降解研究結果表明，該蛋白酶的活性在pH4到9之間受pH的影響不大，但在同種pH條件下的不同緩沖介質中該酶催化Rubisco大亞基的降解情況卻迥然不同。以pH同為7.0時的四種緩沖介質：Tris-HCl，Na2HPO4-NaH2PO4，Na2HPO4-KH2PO4，Na2HPO4-Citric acid為例，在Tris-HCl緩沖

6、液中該蛋白酶催化大亞基的降解作用最為顯著，而在另外三種緩沖介質中大亞基幾乎不發(fā)生降解。在pH7.0的緩沖介質Na2HPO4-NaH2PO4中，通過延長反應時間或者升高反應溫度也無法使Rubisco大亞基產生于在pH7.0的Tris-HCl緩沖液中一樣明顯的降解蛋白條帶。在使用pH7.0的Na2HPO4-NaH2PO4進行粗酶液提取和切膠回收得到的Rubisco溶液中，再加入不同濃度的Tris-HCl(pH7.0)保溫處理后，出現有輕微的

7、Rubisco大亞基的降解片段，但是沒有發(fā)現與上述用Tris-HCl(pH7.0)緩沖液提取和切膠回收的Rubisco一樣明顯的大亞基降解片段，因此，我們認為，Tris-HCl對該蛋白酶還是具有一定的激活作用，但是這種激活作用可能被Na2HPO4-NaH2PO4中的Na+抑制作用所抵消。接著，我們用Tris-HCl(pH7.0)緩沖液提取和切膠回收的Rubisco全酶中加入不同濃度的NaCl進行研究，結果發(fā)現當加入的Na+濃度小于100

8、mmol·L-1時，Rubisco大亞基還是出現了比較明顯的降解條帶，但是，這種降解現象隨著Na+濃度的升高而逐漸減弱；當Na+濃度達到300 mmol·L-1時，基本看不到大亞基被降解的蛋白片段。由此，我們可以確定在Rubisco大亞基的降解作用中，高濃度的Na+起抑制作用。另外，根據該蛋白酶是一種絲氨酸型蛋白酶的實驗結果，本文還創(chuàng)建了一種以人工合成底物(Boc-LRR-AMC)快速檢測該蛋白酶活性的熒光檢測方法，并就抑制劑、pH和N