T7肽通過下調Ang-2表達及聯合3-MA發(fā)揮其抗血管生成的實驗研究.pdf

1、目的：
　　據統(tǒng)計，肝癌在全球腫瘤發(fā)病率中居第六位，在惡性腫瘤致死率中居第二位，其中肝細胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)約占肝癌總發(fā)病率的78％。HCC是一類富血管惡性實體腫瘤，起病隱匿、發(fā)展迅速、易于復發(fā)及侵襲轉移，而腫瘤內的新生血管生成在HCC的發(fā)展及侵襲轉移過程中發(fā)揮著極其重要的作用。目前，靶向干預腫瘤血管生成的藥物及其相關作用機制研究已成為關注熱點。索拉非尼是目前臨床上唯一用于治療晚期肝細

2、胞肝癌的分子靶向藥物，其具有明顯抗肝癌細胞增殖及抑制肝癌血管生成的作用，可提高晚期肝癌患者中位生存期約2-3月。然而，索拉非尼的耐藥性成為限制其臨床廣泛應用的重要因素之一。因此，探索新型的血管生成抑制劑及其相關作用機制的研究可為索拉非尼的替代治療或聯合用藥方案的制定提供新的實驗理論依據。
　　腫瘤抑素(Tumstatin)是源于Ⅳ型膠原蛋白α3鏈的新型內源性血管生成抑制劑，其主要通過降低哺乳動物雷帕霉素靶體(mammalian t

3、arget of rapamycin，mTOR)活性抑制內皮細胞(endothelial cell，EC)內蛋白質的合成及其增殖，發(fā)揮其抗血管生成作用。T7肽是全長Tumstatin內的74-98氨基酸殘基序列，其具有與全長的Tumstatin相同的抗血管生成活性，且L、V、D氨基酸是T7肽發(fā)揮抗血管生成活性的主要氨基酸。但是T7肽具體調控機制尚不甚明確。因此，探索與T7肽抑制血管生成活性相關的信號通路及下游靶蛋白和靶基因可為未來T7肽

4、的臨床成藥的可能性及應用提供理論實驗依據。
　　血管生成素(Angiopoietin，Ang)是除血管內皮生長因子(Vascular endothelialgrowth factor，VEGF)外另一重要的促血管生成因子，其蛋白家族主要包括Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4，其中Ang-2主要存在于內皮細胞的韋伯潘力氏小體（Webel Paladebody，WPB）。在腫瘤缺氧微環(huán)境下，Ang-2可由WPB快速釋放，促

5、進血管內皮細胞與細胞外基質及內皮細胞間的解離，活化并促進內皮細胞的遷移，同時可增強內皮細胞對VEGF的敏感性，進而促進血管生成。而且在肝癌組織中Ang-2蛋白表達也被發(fā)現明顯增加，并伴有肝細胞肝癌血管生成增加，可加速肝細胞肝癌的發(fā)展及侵襲轉移。作為調控腫瘤血管生成的重要分子蛋白，Ang-2的具體作用機制及其在T7肽抑制血管生成過程中的作用具有重要研究意義。自噬(Autophagy)是細胞利用自身溶酶體降解胞內損害的細胞器和大分子物質的過

6、程。自噬在血管生成中的作用已引起人們的重視，而某些血管生成抑制劑可誘導臍靜脈內皮細胞自噬的增加，增強內皮細胞抗凋亡能力，進而拮抗甚至逆轉血管生成抑制劑的抗血管生成活性，在一定程度上阻止了抗血管生成藥物的效果。因此，聯合自噬抑制劑如3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)以增強抗血管生成藥物的敏感性已進入人們的研究視野。3-MA可靶向作用于Ⅲ型PI3K，抑制吞噬泡對胞內成分的包裹，進而達到其抑制自噬的目的。
　　靶

7、向干預肝細胞肝癌血管生成的分子藥物研究對于延長肝癌患者的生存期及改善遠期預后至關重要。我們主要探尋Tumstatin中具有抗血管生成活性的T7肽片段調控的相關信號通路及下游可能的調控靶蛋白，以及促血管生成因子Ang-2在T7肽的抗血管生成活性中的作用，并進一步研究T7肽與內皮細胞自噬之間的相關性及其對血管生成的影響。
　　方法：
　　1.人肝癌細胞系HepG2裸鼠異位成瘤，隨機分為對照組和實驗組(n=15)，分別腹腔給予生理

8、鹽水和T7肽(4.4mg/Kg)，22天后裸鼠脫頸處死，獲取腫瘤標本，蠟塊包埋切片，通過免疫組織化學方法，檢測腫瘤組織內VE-鈣粘蛋白和CD31蛋白的表達，分析T7肽在體內是否存在抑制血管生成作用。
　　2.我們選取人臍靜脈內皮細胞(Human umbilical vein cells，HUVECs)作為體外實驗對象，缺氧培養(yǎng)箱提供細胞培養(yǎng)缺氧環(huán)境(37℃，1％ O2，5％ CO2，94％ N2)，分別設置為常氧組、缺氧組、T7肽

9、（1.0μM）+缺氧組，體外小管形成實驗進一步分析體外T7肽在缺氧環(huán)境下對于血管生成的影響。
　　3.為明確T7肽抑制血管生成的相關機制，在缺氧環(huán)境下HUVECs用不同濃度T7肽（0.25μM，0.5μM，1.0μM，2.0μM）處理24 h，CCK-8法觀察細胞活力變化，并選取T7肽（1.0μM）進行后續(xù)實驗。在缺氧環(huán)境下T7肽分別處理HUVECs12 h和24 h，通過CCK-8法觀察細胞活力變化。
　　4.對數生長期H

10、UVECs分別設置為常氧組、缺氧組、缺氧+T7肽組，培養(yǎng)24 h后，AnnexinⅤ-FITC法檢測細胞凋亡情況。提取細胞總蛋白后，Western blot法檢測細胞相關凋亡蛋白Bax及Bcl-2的表達情況。
　　5.為明確Ang-2是否為T7肽的調節(jié)靶點及其相關信號通路，我們在上述實驗基礎上加入缺氧+MK2206(5.0μM)組，MK2206為Akt特異性抑制劑，可作為缺氧+T7肽組的陽性對照組，培養(yǎng)HUVECs24 h，提取細

11、胞蛋白，通過Western blot法檢測相關蛋白Ang-2、Akt、p-Akt的表達情況。
　　6.在方法4實驗分組的基礎上，我們加入缺氧+T7肽+rhAng-2(15 ng)組，分別通過細胞劃痕實驗和Transwell法觀察內皮細胞遷移能力變化。
　　7.探索T7肽及Ang-2在肝癌細胞侵襲方面的作用，我們Transwell板上室接種HepG2細胞，下室接種HUVECs，下室HUVECs設置為常氧組、缺氧組、缺氧+T7肽

12、組、缺氧+T7肽+rhAng-2組，留取下室細胞培養(yǎng)上清液，ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清內Ang-2表達，Transwell法觀察HepG2細胞的侵襲能力變化。6孔板內HUVECs設置為上述4組，留取細胞培養(yǎng)上清液，離心后用于培養(yǎng)HepG2細胞，24 h后提取總蛋白，Western blot法檢測肝癌細胞內MMP2的表達情況。
　　8.為探索T7肽在細胞自噬方面的作用，我們首先在缺氧環(huán)境下用T7肽處理臍靜脈內皮細胞，丫啶橙染色觀察

13、自噬溶酶體形成情況。然后在相同條件下設置3-MA組、T7肽組、T7肽+3-MA（5.0 nM）組，再次丫啶橙染色觀察自噬溶酶體形成情況，Western blot法檢測內皮細胞LC3-Ⅱ蛋白的表達情況。
　　9.為明確3-MA在T7肽抑制血管生成中的作用，HUVECs設置為缺氧組、缺氧+3-MA組、缺氧+T7肽組、缺氧+T7肽+3-MA組，通過小管形成實驗觀察體外3-MA和T7肽對于血管生成影響，AnnexinⅤ-FITC法檢測內皮

14、細胞凋亡率。
　　結果：
　　1.人肝癌細胞HepG2裸鼠異位腫瘤模型建立，腹腔分別給予生理鹽水和T7肽處理，免疫組織化學染色結果顯示T7肽明顯抑制腫瘤內兩個重要血管內皮細胞標志物VE-鈣粘蛋白和CD31蛋白的表達。體外小管形成實驗也同時顯示缺氧情況下T7肽明顯逆轉缺氧誘導的血管形成增加(P＜0.01)。
　　2.T7肽可明顯抑制內皮細胞活力，且具有濃度依賴性。T7肽濃度為0.5μM時內皮細胞活力高于1.0μM，但二者

15、無統(tǒng)計學意義。T7肽濃度為2.0μM時內皮細胞活力低于20％。選取T7肽濃度為1.0μM進行下一步實驗，CCK-8法檢測顯示T7肽處理24小時的內皮細胞活力明顯低于T7肽處理12小時的內皮細胞活力(P＜0.05)，且相同時間點T7肽可明顯抑制缺氧條件下內皮細胞的活力。
　　3.AnnexinⅤ-FITC檢測顯示缺氧環(huán)境可以降低內皮細胞的凋亡率。相反，T7肽可明顯增加缺氧下內皮細胞的凋亡率(P＜0.01)。Western blot結

16、果顯示T7肽可以逆轉缺氧對于促凋亡蛋白Bax的下調和抗凋亡蛋白Bcl-2的上調(P＜0.01)。
　　4.Western blot顯示缺氧可以誘導Ang-2蛋白表達水平的上調，并同時增加Akt的磷酸化水平(P＜0.01)。但是，缺氧環(huán)境下T7肽可明顯降低內皮細胞Ang-2蛋白的表達水平，抑制Akt的磷酸化(P＜0.01)。我們也發(fā)現Akt特異性抑制劑MK2206在抑制Akt磷酸化水平同時可明顯下調Ang-2的表達水平(P＜0.01

17、)，與T7肽具有相同的下游調節(jié)靶點蛋白。因此，T7肽可以通過下調Akt的磷酸化水平降低Ang-2的表達水平。
　　5.細胞劃痕實驗結果發(fā)現，T7肽可以明顯抑制缺氧誘導的內皮細胞遷移能力的增加(P＜0.05)。聯合應用外源性rhAng-2，內皮細胞遷移能力較單獨使用T7肽處理時明顯增強(P＜0.05)。結果表明Ang-2蛋白可以增加內皮細胞的遷移能力。Transwell實驗結果與細胞劃痕實驗結果一致。
　　6.ELISA法檢測

18、發(fā)現，缺氧下胞外Ang-2蛋白水平明顯升高，T7肽可抑制上述過程(P＜0.01)。同時我們發(fā)現含有高濃度Ang-2的HUVECs培養(yǎng)上清液可明顯促進肝癌細胞侵襲(P＜0.05)及MMP2蛋白的表達(P＜0.01)。T7肽可通過降低內皮細胞Ang-2的釋放間接調控肝癌細胞的侵襲能力。
　　7.丫啶橙染色顯示T7肽可誘導內皮細胞自噬溶酶體增加，自噬抑制劑3-MA可逆轉此過程，Western blot顯示LC3-Ⅱ蛋白表達水平可被T7肽

19、明顯提高(P＜0.01)。自噬抑制劑3-MA在缺氧環(huán)境下可誘導內皮細胞凋亡，降低體外血管生成(P＜0.01)。聯合自噬抑制劑3-MA，T7肽導致的細胞凋亡率較單獨使用T7肽時明顯增高(P＜0.01)，小管形成實驗亦顯示聯合應用3-MA和T7肽具有更強的抑制血管生成能力(P＜0.05)。
　　結論：
　　1.缺氧環(huán)境下T7肽在體內及體外均具有明顯抑制血管生成作用。
　　2.T7肽可以通過促進內皮細胞的凋亡和抑制內皮細胞活

20、力發(fā)揮其抗血管生成活性。
　　3.T7肽可通過靶向抑制Ang-2表達而降低內皮細胞遷移能力，進而抑制血管生成。磷酸化的Akt水平降低在二者之間起“橋梁”作用。
　　4.T7肽可通過下調Ang-2表達抑制肝癌細胞的侵襲轉移。Ang-2在腫瘤的侵襲中發(fā)揮重要作用。
　　5.自噬抑制劑3-MA可抑制血管生成，并能協(xié)同增加T7肽在降低血管生成和增加細胞凋亡中的作用。同時可推測T7肽誘導的內皮細胞自噬增強可在一定程度上拮抗T7肽

21、的抑血管生成作用。
　　意義：
　　1.發(fā)現了T7肽可通過促進內皮細胞凋亡、抑制內皮細胞遷移及活力發(fā)揮其抗血管生成作用。
　　2.證實Ang-2可作為T7肽抗血管生成作用的調控靶點，并發(fā)現Akt通路的“橋梁”作用，為T7肽及Ang-2在腫瘤血管生成方面的進一步研究提供實驗理論依據。
　　3.揭示了T7肽可通過調控Ang-2表達發(fā)揮抗血管生成及抑制腫瘤細胞侵襲轉移的作用。
　　4.自噬抑制劑可增強T7肽的抗血