miR-155調(diào)控PDCD4的炎癥反應(yīng)影響粥樣斑塊穩(wěn)定性的機制研究.pdf

1、目的:
　　本課題，我們擬探索miR-155和PDCD4在動脈粥樣硬化小鼠主動脈組織和ox-LDL處理的RAW264.7細胞中的表達情況并闡明相互之間的關(guān)系。論證miR-155是否直接抑制SOCS1表達進而影響PDCD4在巨噬細胞中的表達，同時進一步的探討了miR-155作用于PDCD4的具體機制。課題中我們將從動物實驗及細胞實驗兩部分進行驗證miR-155與PDCD4之間的關(guān)系，在動物實驗中我們將建立實驗相關(guān)的ApoE-/-小鼠

2、動物模型，明確miR-155與PDCD4及其下游炎癥因子，如IL-10，IL-6，TNF-α之間的關(guān)系，然后建立用ox-LDL刺激巨噬細胞，建立巨噬細胞粥樣硬化模型，并應(yīng)用腺病毒感染過表達SOCS1，轉(zhuǎn)染siRNA沉默PDCD4、STAT3，antagomiR-155抑制miR-155等方法，運用油紅O染色，熒光免疫標測，Western blot，Real-time PCR，ELISA等方法測定蛋白、基因及細胞共定位。最終驗證miR-1

3、55可能通過SOCS1-STAT3-PDCD4軸促進巨噬細胞進炎癥反應(yīng)，進一步影響動脈粥樣斑塊的穩(wěn)定性，進而導(dǎo)致斑塊破裂，心血管事件的發(fā)生。理論上的佐證，希望能為臨床動脈粥樣硬化疾病的治療提供新的思路和治療靶點。
　　方法:
　　第一部分 動物實驗觀察miR-155與PDCD4及各種炎癥因子之間的關(guān)系
　　動物實驗C57野生型小鼠及ApoE-/-小鼠均統(tǒng)一購自南京大學動物中心，雄性，6周齡，體重17-20g。喂養(yǎng)飼料:

4、C57野生型小鼠、ApoE-/-小鼠正常飲食組使用常規(guī)小鼠顆粒飼料;ApoE-/-小鼠高脂飲食組使用常規(guī)小鼠顆粒飼料混合（1.25％膽固醇和21％脂肪）。
　　第二部分 細胞實驗觀察miR-155調(diào)控PDCD4及各種炎癥因子的表達變化
　　細胞實驗觀察了ox-LDL刺激下的RAW264.7巨噬細胞中，miR-155與PDCD4及TNF-α、IL-6、IL-10三種炎癥因子的表達變化。體外培養(yǎng)RAW264.7巨噬細胞株，用ox

5、-LDL刺激RAW264.7細胞株以模擬動脈粥樣硬化疾病的在體因素。使用Western blot、Real-time PCR技術(shù)觀察不同濃度ox-LDL刺激下的miR-155與PDCD4的基因和蛋白表達變化，ELISA技術(shù)檢測細胞中TNF-α、IL-6、IL-10三種炎癥因子的蛋白表達水平。應(yīng)用miR-155的抑制劑Anti-miR-155轉(zhuǎn)染細胞后觀察PDCD4的基因及蛋白表達變化，應(yīng)用PDCD4的siRNA片段沉默PDCD4表達后觀

6、察TNF-α、IL-6、IL-10的基因及蛋白表達。闡述了ox-LDL刺激下的RAW264.7巨噬細胞中，miR-155調(diào)控PDCD4，以及PDCD4調(diào)控三種炎癥因子表達的內(nèi)在機制。
　　第三部分 細胞實驗研究miR-155調(diào)控PDCD4及各種炎癥因子的分子機制
　　在第二部分實驗基礎(chǔ)上，我們進一步利用Targetscan網(wǎng)站對miR-155的靶點進行預(yù)測，顯示SCOS1是miR-155的靶基因，我們設(shè)計SCOS1的3'UT

7、R區(qū)段，并對其進行提純、酶切、轉(zhuǎn)染、測序及熒光報告基因檢測后驗證了SCOS1是miR-155的靶基因。然后應(yīng)用腺病毒載體構(gòu)建過表達SOCS1基因，并將其感染RAW264.7巨噬細胞，觀察SCOS1/STAT3、PDCD4的基因及蛋白表達情況，同時運用轉(zhuǎn)染技術(shù)將miR-155、Anti-miR-155、STAT3siRNA轉(zhuǎn)染至細胞中，觀察SCOS1/STAT3信號通路及PDCD4炎癥因子的變化情況。應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測S

8、COS1/STAT3、PDCD4的蛋白表達情況，Real-time PCR技術(shù)檢測基因的表達變化，以便觀察miR-155調(diào)控PDCD4及各種炎癥因子的內(nèi)在分子機制。
　　結(jié)果:
　　第一部分 動物模型中，抑制miR-155的表達可抑制PDCD4及各種促炎因子的表達
　　動物實驗結(jié)果顯示，C57野生型小鼠、ApoE-/-小鼠正常飲食、ApoE-/-小鼠高脂喂養(yǎng)三組，miR-155的表達在ApoE-/-小鼠高脂喂養(yǎng)組最高，

9、明顯增加;三組間的IL-6、TNF-α的基因和蛋白表達趨勢與miR-155的表達趨勢相同，IL-10的基因及蛋白表達與之相反;相比于ApoE-/-小鼠高脂喂養(yǎng)組，ApoE-/-小鼠高脂喂養(yǎng)+Anti-NC組兩者的炎癥反應(yīng)因子的表達無明顯變化。應(yīng)用FISH檢測發(fā)現(xiàn)miR-155定位于主動脈及斑塊中。比較ApoE-/-小鼠高脂喂養(yǎng)+Anti-NC及ApoE-/-小鼠高脂喂養(yǎng)+Anti-miR-155兩組，油紅染色發(fā)現(xiàn)Anti-miR-155

10、干預(yù)組的斑塊面積明顯較Anti-NC組減少;Mason染色同樣也發(fā)現(xiàn)Anti-miR-155干預(yù)組的斑塊面積明顯較Anti-NC組減少。此外，Anti-miR-155干預(yù)組主動脈組織中miR-155及CD68的表達顯著受到抑制。進一步研究炎癥信號相關(guān)通路時，我們發(fā)現(xiàn)Anti-miR-155干預(yù)組抑炎因子SOCS1表達增加，促炎因子p-STAT3表達減少，炎癥因子PDCD4的表達亦減少。而作用于動物粥樣硬化斑塊并促進其形成的促炎因子IL-

11、6、TNF-α在Ant i-miR-155干預(yù)組表達受抑制，而IL-10在Anti-miR-155干預(yù)組的表達顯著升高。以上研究說明在動物粥樣硬化模型中，應(yīng)用Anti-miR-155干預(yù)后，miR-155及炎癥細胞的表達減少，促進炎癥反應(yīng)信號通路及促炎因子的表達受到抑制，如p-STAT3、PDCD4、IL-6、TNF-α，抑制炎癥反應(yīng)信號通路及保護性因子的表達受到得到加強，如SOCS1、IL-10。提示miR-155與斑塊的發(fā)生、發(fā)展關(guān)

12、系密切，且可能與SOCS1/p-STAT3、PDCD4信號途徑有關(guān)，并調(diào)控各種炎癥因子的表達。
　　第二部分 ox-LDL刺激的巨噬細胞中，miR-155調(diào)控PDCD4的表達并通過PDCD4調(diào)控各種炎癥因子的表達
　　細胞實驗中，我們模擬體外高脂飲食構(gòu)建模型中體內(nèi)環(huán)境的變化情況，選擇應(yīng)用ox-LDL來刺激RAW264.7巨噬細胞株，構(gòu)建實驗用巨噬細胞模型并檢測miR-155表達時發(fā)現(xiàn)，miR-155的表達與ox-LDL刺激的

13、濃度及時間相關(guān)，呈濃度依賴性及時間依賴性，這與動物實驗中的ApoE-/-小鼠高脂喂養(yǎng)組比ApoE-/-小鼠正常飲食喂養(yǎng)組及野生小鼠的miR-155表達要高的實驗結(jié)果一致;同時檢測PDCD4及IL-6、TNF-α、IL-10炎癥因子時我們也發(fā)現(xiàn)了和動物實驗近乎一致的結(jié)果。為證明miR-155與PDCD4及三種炎癥因子的關(guān)聯(lián)性，我們在ox-LDL刺激的RAW264.7巨噬細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染了Anti-miR-155觀察PDCD4基因及蛋白表達時發(fā)現(xiàn)

14、，轉(zhuǎn)染Anti-miR-155后，miR-155被抑制的同時，PDCD4基因及蛋白表達亦受抵制，說明巨噬細胞內(nèi)miR-155可以調(diào)控PDCD4的表達;在該模型下進一步應(yīng)用PDCD4siRNA沉默PDCD4表達后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染Anti-miR-155所致的TNF-α、IL-6、IL-10的表達變化，在轉(zhuǎn)染PDCD4siRNA后可部分翻轉(zhuǎn)，說明miR-155引起的巨噬細胞內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-10的表達變化部分是通過PDCD4途徑來實現(xiàn)

15、。
　　第三部分 ox-LDL刺激的巨噬細胞中，miR-155通過SOCS1/p-STAT3途徑調(diào)控PDCD4的表達
　　我們首先驗證了SCOS1是miR-155的靶基因，直接在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-155后，SOCS1的基因表達明顯受抑制。然后我們觀察了轉(zhuǎn)染后的SOCS1/p-STAT3的表達變化，發(fā)現(xiàn)當細胞內(nèi)miR-155表達增加后，SOCS1作為靶基因其表達受抑制外，其下游的重要促炎信號通路STAT3的磷酸化明顯加強，p-

16、STAT3增加，說明miR-155的增加可促進炎癥信號通路的信號放大。而在轉(zhuǎn)染Anti-miR-155進入巨噬細胞后，SOCS1/p-STAT3及PDCD4的表達明顯受抑制。在前細胞實驗中我們也發(fā)現(xiàn)，ox-LDL刺激巨噬細胞中，轉(zhuǎn)染了anti-miR-155也可抑制PDCD4表達水平。以上結(jié)果說明巨噬細胞中miR-155、SOCS1/p-STAT3及PDCD4三者間存在著關(guān)聯(lián)。實驗結(jié)果顯示，RAW264.7巨噬細胞中，ox-LDL+過表

17、達SOCS1組與ox-LDL刺激組相比，ox-LDL所致的p-STAT3及PDCD4高表達效果在轉(zhuǎn)染SOCS1后明顯受抑制;同樣在ox-LDL刺激時轉(zhuǎn)染STAT3siRNA，相比于ox-LDL刺激組亦出現(xiàn)了上述相同的結(jié)果。因此，我們認為ox-LDL刺激的巨噬細胞中，miR-155可通過SOCS1/STAT3的信號途徑促進PDCD4的表達。
　　結(jié)論:
　　1.在動物水平發(fā)現(xiàn)，miR-155發(fā)揮促進動脈粥樣硬化以及斑塊形成的作