甘氨酸-氮氧自由基綴合物對缺血再灌注損傷的保護作用及其內在機制的研究.pdf

1、缺血再灌注損傷（Ischemic reperfusion injury,I/R）是臨床上缺血性外傷和疾病所面臨的一個重要威脅。針對缺血再灌注損傷，開發(fā)出有效的預防和治療藥物具有實際意義。目前普遍的觀點認為缺血再灌注損傷的機理主要與過量氧自由基的產生、中性粒細胞介導的炎癥和鈣超載等因素相關。目前針對這些不同的機制均研發(fā)出了一些行之有效的藥物，但是在臨床上的效果都不甚理想。本課題從綜合的觀點出發(fā)，將具有抗氧化作用的氮氧自由基和具有抗炎癥作用

2、的甘氨酸綴合起來形成甘氨酸-氮氧自由基綴合物（GNN綴合物），通過大鼠雙后肢缺血再灌注模型和腎缺血再灌注模型觀察其對原位缺血組織和遠端器官的保護作用，并通過建立體外臍靜脈內皮細胞缺氧復氧模型來探討起內在的分子機制。
　　第一部分：甘氨酸-氮氧自由基綴合物聯(lián)合缺血后處理對大鼠雙后肢缺血再灌注損傷的治療作用
　　目的：
　　本部分實驗通過對缺血組織后處理聯(lián)合靜脈注射GNN綴合物的方式來共同應對大鼠雙后肢缺血再灌注損傷，進而

3、在體內層面評估GNN綴合物聯(lián)合缺血后處理在急性雙后肢缺血再灌注損傷大鼠模型中對多器官損傷的治療作用。
　　方法：
　　大鼠按隨機原則分為五組：
　　（1）假手術組（6只）：該組進行常規(guī)的麻醉后，不予以缺血再灌注處理，7h后同其他組一起處理動物；
　　（2）缺血再灌注組（8只）：缺血3 h后，恢復供血4 h后處理動物；
　　（3）單純缺血后處理組（8只）：缺血3 h，于終止缺血前15 min靜脈注射PBS，終

4、止缺血后，以2 min間隔反復阻斷并恢復供血四個循環(huán)，然后恢復血供，4 h后處理動物；
　?。?）GNN干預組（8只）：缺血3 h，于恢復灌注前15 min以10mg/kg/min靜脈注射GNN，然后恢復血供，4 h后處理動物；
　　（5）GNN合并缺血后處理組（8只）：缺血3 h，于恢復灌注前15 min靜脈注射GNN，劑量同前，松解阻斷后，以2 min間隔反復阻斷并恢復供血四個循環(huán)，然后恢復血供，4 h后處理動物。

5、>　　缺血再灌注處理方式：術前大鼠進行常規(guī)禁食12 h，僅給予飲水自由。使用戊巴比妥鈉（40 mg/kg）行腹腔注射麻醉，電熱毯維持體溫于37℃，用止血帶包扎大鼠雙側后肢根部，使后肢缺血3h后，撤除止血帶，實現(xiàn)再灌注4h。各組恢復供血4h后，分別股靜脈取血，分離血清，進行丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、組織髓過氧化物酶（myeloperoxidase， MPO）活性、血清丙氨酸轉氨酶（ALT），天冬氨酸轉氨酶（AST）

6、，血尿素氮（BUN）及血肌酐（Cr）含量的測定；ELISA技術檢測血清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平；處死動物，分別收集肌肉、肺、肝、腎組織，分別進行肌肉和肺組織的濕重/干重（W/D）比例的測定；流式細胞術檢測肌肉、肝、腎組織的細胞凋亡情況；部分肺組織勻漿，檢測 MDA和MPO水平或活性。
　　結果：
　　1.GNN在體內后肢缺血再灌注模型中對各臟器細胞凋亡的保護作用:流式檢測結果表明在大鼠后肢缺血再灌注模型的基礎上，使

7、用GNN干預后，腎臟和肌肉細胞的凋亡狀況得到明顯改善。
　　2.組織水腫程度:與假手術組相比（肌肉：4.02±0.26；肺：3.66±0.32），缺血再灌注發(fā)生后，肌肉和肺組織的W/D比值（肌肉：6.07±0.37；肺：5.73±0.38）均有所升高。單純缺血后處理雖然可以一定程度上緩解肌肉和肺組織水腫（肌肉：5.42±0.41；肺：5.01±0.39），但是不具有統(tǒng)計學意義。而單一GNN治療組（肌肉：4.86±0.38；肺：4.

8、50±0.27）及GNN合并缺血后處理治療組（肌肉：4.45±0.39；肺：4.02±0.34）均可以緩解水腫情況，且聯(lián)合處理的效果更明顯。
　　3.血清及肺組織勻漿MDA水平：缺血再灌注損傷過程中，血清（3.45±0.44 nmol/ml）及肺組織（84.50±3.70 nmol/g）中MDA的水平明顯高于假手術組（血清：1.67±0.13 nmol/ml；肺組織：41.80±3.20 nmol/g）。但是單純缺血后處理無法降低

9、MDA水平（血清：2.96±0.57 nmol/ml；肺組織：70.40±4.20 nmol/g）。單純GNN治療（血清:2.28±0.38 nmol/ml；肺組織：60.30±3.50 nmol/g）與GNN聯(lián)合缺血后處理組（血清:1.89±0.20 nmol/ml；肺組織：52.70±4.90 nmol/g）均可明顯抑制MDA產生，且GNN聯(lián)合缺血后處理組的效果更加明顯。
　　4.組織氧化應激損傷的指標—MPO活性檢測結果：缺

10、血再灌注組大鼠肺組織MPO水平（19.30±1.91 U/g）顯著高于假手術組大鼠（8.02±0.62 U/g）。單純GNN治療組大鼠（10.41±1.20 U/g）及GNN合并缺血后處理治療組大鼠（9.33±1.31 U/g）較缺血再灌注損傷大鼠MPO活性明顯降低，后者更加顯著。
　　5.TNF-α檢測結果：缺血再灌注組大鼠血清中TNF-α表達水平（130.62±5.71 pg/ml）顯著高于假手術組（51.22±6.90pg/

11、ml）。單純GNN治療組（85.81±9.12 pg/ml）及GNN合并缺血后處理治療組（72.20±9.51 pg/ml）較缺血再灌注組的炎性細胞因子水平均顯著下降。GNN合并缺血后處理雖然比單純GNN治療組TNF-α的表達水平低，但是它們之間沒有統(tǒng)計學差異。
　　6.GNN聯(lián)合缺血后處理能夠改善大鼠的肝腎功能：缺血再灌注組大鼠血清AST及ALT（AST:63.60±13.41μM;ALT:110.41±43.92μM）水平顯著

12、高于假手術組大鼠（AST:147.31±21.30μM;ALT:302.32±54.30μM）；單純GNN干預組大鼠（AST:92.21±23.62μM;ALT:203.90±43.92μM）及GNN合并缺血后處理（AST:78.74±16.81μM;ALT:177.32±33.61μM）均可有效降低 ALT及AST的水平，且聯(lián)合處理組的效果顯著優(yōu)于單一的GNN干預組。缺血再灌注組（BUN:14.20±2.12 mM;Cr:62.31±

13、2.43 mM）與假手術組（BUN:7.33±1.90 mM;Cr:34.92±2.51 mM）相比，血清BUN水平和Cr水平顯著升高；單一GNN干預（BUN:9.91±2.52 mM;Cr:45.32±2.11 mM）及GNN合并缺血后處理治療（BUN:8.73±1.60 mM;Cr:40.91±1.82 mM），均可顯著降低血清BUN和Cr水平。
　　第二部分：甘氨酸-氮氧自由基綴合物干預對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用

14、>　　目的：
　　本部分實驗旨在利用大鼠腎缺血再灌注模型研究GNN綴合物干預對腎I/R損傷的保護作用，以確定GNN綴合物在I/R損傷干預治療中的有效性。
　　方法：
　　選取健康潔凈級Wistar大鼠16只（雄性,月齡4月，體重250～300g），隨機分為三組。
　　（1）假手術組（4只）：該組動物僅進行常規(guī)麻醉，不予以缺血再灌注處理；
　?。?）腎缺血再灌注組（6只）：動脈夾完全阻斷腎臟血流1 h后恢復血

15、供，3h后處理動物；
　?。?）缺血再灌注+GNN治療組（6只）:動脈夾完全阻斷腎臟血流1 h，在恢復血供前15 min以30 mg/kg的量腹腔注射GNN綴合物，恢復血供3 h后處理動物；收集血清，檢測尿素氮水平；收集部分腎組織，分別檢測MDA、GSH水平及MPO活性；部分腎組織制備冰凍切片，HE染色觀察腎組織的形態(tài)變化。
　　結果：
　　1.GNN綴合物可減弱腎組織因缺血再灌注帶來的脂質過氧化反應：大鼠腎缺血再灌注

16、損傷過程中，腎組織中 MDA的水平（72.11±4.11 nmol/g）明顯高于假手術組（31.42±2.80 nmol/g）。GNN干預（36.51±2.42 nmol/g）后顯著抑制MDA的產生。
　　2.GNN可以有效地維持自由基清除劑GSH的水平：缺血再灌注導致腎組織內的GSH水平明顯降低（Sham假手術組：1.50±0.30μmol/g，缺血再灌注組：0.81±0.20μmol/g），GNN干預可以恢復GSH的含量（1.

17、41±0.11μmol/g）。
　　3.GNN可有效降低缺血再灌注腎組織中MPO活性：腎缺血再灌注組大鼠腎組織MPO水平（15.21±0.82 U/g）顯著高于假手術組大鼠（4.63±0.73 U/g），而GNN綴合物干預后MPO活性明顯降低（5.71±0.52 U/g）。
　　4.GNN可有效改善缺血再灌注大鼠腎功能和腎組織損傷：腎缺血再灌注損傷組大鼠血清BUN水平（50.91±4.21 mg/dl）顯著高于假手術組大鼠（

18、14.52±2.30 mg/dl），；GNN綴合物干預可有效降低BUN水平（17.51±3.51 mg/dl）。
　　HE染色結果顯示，缺血再灌注組的腎臟與假手術組相比較，發(fā)生嚴重的腎小管壞死和腎小球損傷。而缺血再灌注損傷+GNN治療組的腎臟組織的損傷明顯減輕。
　　第三部分甘氨酸-氮氧自由基綴合物對血管內皮細胞HUVEC缺氧復氧損傷的保護作用及內在機制的研究
　　目的：
　　為了系統(tǒng)性研究GNN綴合物對缺血再灌

19、注損傷調節(jié)作用的內在細胞和分子機制，本部分通過體外實驗檢測該綴合物對人臍靜脈內皮細胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）缺氧復氧過程中細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡、細胞自噬和線粒體形態(tài)與功能的調節(jié)作用，為后期分子信號通路的研究提供了實驗基礎。
　　方法：
　　1.HUVECs的分離與培養(yǎng)：取健康產婦正常足月分娩嬰兒的臍帶（15 cm），用I型膠原酶分離收集HUVECs

20、，種于100μg/ml層黏連蛋白預包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，VIII因子相關抗原鑒定為陽性。
　　2.構建體外的缺氧復氧模型：取3-6代的HUVEC細胞，分為正常對照組、缺氧復氧組（T8R4）、缺氧復氧聯(lián)合GNN2μg/ml處理組（T8R4+D2）和缺氧復氧聯(lián)合GNN5μg/ml處理組（T8R4+D5）。MTT、SRB實驗檢測細胞增殖情況，流式細胞術檢測細胞周期和細胞凋亡的改變，激光共聚焦顯微鏡結合免疫熒光技術檢測JC-1、細胞色素c（

21、Cytochrome c）和自噬相關蛋白LC3在細胞內的分布，qPCR和Western blot方法檢測細胞周期、凋亡和線粒體相關基因的變化，透射電鏡觀察細胞線粒體形態(tài)的變化。
　　結果：
　　1.甘氨酸-氮氧自由基綴合物可以恢復缺氧復氧對 HUVEC細胞增殖能力的抑制作用:缺氧復氧處理可以顯著抑制HUVEC細胞的增殖水平，但當GNN綴合物干預缺氧復氧模型時，HUVEC細胞的增殖水平增加。
　　2.GNN綴合物無法逆轉

22、缺氧復氧對HUVEC細胞周期的抑制:與對照組相比，缺氧復氧可以明顯地抑制細胞周期的進程，即G1期的比例顯著增高，而S期+G2/M期的比例顯著減少。但是當在缺氧復氧的基礎上，用不同濃度的GNN綴合物干預，細胞周期并沒有得到明顯的改善。同時，缺氧復氧處理后，CCNB1、CCND1、CCNE1受到明顯抑制，而p53的表達沒有變化；當在缺氧復氧的基礎上，用不同濃度的GNN綴合物處理細胞后，CCNB1、CCND1、CCNE1在mRNA水平和蛋白水

23、平的表達并沒有改變。
　　3.GNN綴合物顯著緩解缺氧復氧對HUVEC細胞凋亡的促進作用，上調BCL2表達，降低Bax和BAD表達：與對照組相比，缺氧復氧可以明顯地促進細胞凋亡的發(fā)生，包括細胞的早期凋亡和晚期凋亡。但是當在缺氧復氧的基礎上，用不同濃度的GNN綴合物在復氧階段前干預細胞，細胞凋亡率明顯減少。
　　qPCR和Western blot結果顯示，在缺氧復氧處理后，促凋亡基因Bax、BAD的表達明顯升高，而抗凋亡基因B

24、CL2的表達顯著下調。GNN綴合物后，Bax和BAD升高明顯受到抑制，而BCL2的表達出現(xiàn)回調（Fig.3C-3D）。而p53的表達水平無論是在mRNA水平還是在蛋白水平均未發(fā)生變化。
　　4.GNN綴合物能夠恢復缺氧復氧對HUVEC細胞線粒體形態(tài)與功能的損傷：
　　1）與對照組相比，缺氧復氧可以明顯地促進細胞線粒體膜電位的降低，JC-1綠色熒光的增多，但是缺氧復氧聯(lián)合GNN綴合物處理后，JC-1綠色熒光明顯減少。
　

25、　2）Confocal檢測了不同處理組細胞中細胞色素c的分布情況，結果顯示，在正常的HUVEC細胞中，Cytochrome c染色集中在線粒體，而在缺氧復氧處理后，Cytochrome c則呈彌散分布。但是缺氧復氧聯(lián)合GNN綴合物處理后，部分Cytochrome c又出現(xiàn)線粒體聚集。
　　3）qPCR結果顯示，與正常對照相比，缺氧復氧處理后，DRP1的表達明顯升高，而MFN1、MFN2和OPA1的表達明顯降低，而聯(lián)合GNN綴合物處

26、理后，DRP1的升高受到明顯抑制，而MFN1、MFN2和OPA1的表達得到恢復。
　　4）透射電鏡結果顯示，缺氧復氧會造成線粒體的非正常斷裂，而聯(lián)合GNN綴合物處理可以明顯改善線粒體的斷裂情況。
　　5.GNN綴合物明顯抑制缺氧復氧造成HUVEC細胞自噬的發(fā)生：與正常對照組相比，缺氧復氧可以明顯地促進細胞自噬的發(fā)生，LC3呈斑點狀聚集，但是GNN綴合物干預后，LC-3呈彌散。
　　結論：
　　1.在體內，分別利用

27、了雙后肢缺血再灌注和腎臟缺血再灌注兩個模型證明了GNN的保護作用。一方面，GNN可以清除機體內過量的自由基，減輕脂質過氧化反應，另一方面，GNN可以有效地減輕炎癥反應，緩解缺血再灌注造成的局部和遠端臟器損傷。該結果不但證明了多種細胞行為參與了GNN綴合物的保護作用，還證明了GNN綴合物在各種器官缺血再灌注損傷中的普適性，同時能夠保護缺血再灌注損傷引發(fā)的多器官損傷。
　　2.GNN綴合物在體外具有顯著的抗缺氧復氧所引起的HUVEC細