大型褐藻配子體培養(yǎng)及海帶自交系A(chǔ)FLP分析.pdf

1、海帶、裙帶菜等大型褐藻配子體既是商業(yè)化海藻養(yǎng)殖、育種和育苗技術(shù)的重要材料來(lái)源，也是目前進(jìn)行海藻遺傳學(xué)等研究的切入點(diǎn)，因此如何獲得能夠滿足不同實(shí)驗(yàn)需求的配子體成為人們研究的焦點(diǎn)。本文從成熟裙帶菜孢子葉采集游孢子開(kāi)始到配子體發(fā)育形成幼孢子體為止進(jìn)行了跟蹤觀察研究，對(duì)比了光一照強(qiáng)度、溫度、光周期等不同環(huán)境因子對(duì)配子體營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，光強(qiáng)和溫度等外界環(huán)境因素對(duì)配子體生長(zhǎng)和發(fā)育有很大影響，光照越強(qiáng)、光照時(shí)間越長(zhǎng)、溫度越高，配子體的生

2、長(zhǎng)越快，但各種單一因素的影響又表現(xiàn)出一定的差異性。22±1℃、15001x光強(qiáng)、14:10h(L:D)光周期是實(shí)驗(yàn)室中配子體培養(yǎng)的最佳條件；在溫度為18±1℃、光周期14:10h(L:D)、光照強(qiáng)度20001x條件下10天內(nèi)配子體能夠完全發(fā)育形成幼孢子體。 在裙帶菜配子體種質(zhì)保存和培養(yǎng)過(guò)程中，硅藻等雜藻的污染是十分棘手的問(wèn)題。這些雜藻阻礙藻體生長(zhǎng)，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)造成藻種的死亡。硅藻是最常見(jiàn)、最難處理的雜藻污染之一，需要外借藥物來(lái)抑制

3、其生長(zhǎng)。硅藻的生長(zhǎng)溫度范圍廣，適應(yīng)能力特別強(qiáng)，繁殖十分迅速。在配子體培養(yǎng)中硅藻與配子體爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)、光照等生長(zhǎng)條件，限制其正常的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致配子體得不到足夠的光照和營(yíng)養(yǎng)而變綠死亡。本研究篩選了裙帶菜配子體對(duì)二氧化鍺毒性的耐受濃度范圍，并對(duì)硅藻的生長(zhǎng)變化進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，在本試驗(yàn)中應(yīng)當(dāng)選擇1～5mg/L二氧化鍺作為裙帶菜配子體種質(zhì)保存和培養(yǎng)過(guò)程中的硅藻抑制劑，最佳濃度為1mg/L，此時(shí)的配子體能夠正常營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，硅藻污染降到最低，與其他已

4、經(jīng)報(bào)道的幾種海藻培養(yǎng)所用二氧化鍺濃度相似。 以上述配子體培養(yǎng)和雜交育種技術(shù)為基礎(chǔ)，培育了我國(guó)主要養(yǎng)殖海帶品種的自交系和混交系。在海帶遺傳育種研究中，僅根據(jù)其形態(tài)特征對(duì)海帶種質(zhì)進(jìn)行鑒定是不夠的，有必要通過(guò)生化及DNA分子標(biāo)記等技術(shù)進(jìn)行種質(zhì)鑒定和遺傳關(guān)系分析。實(shí)驗(yàn)利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，以野生品種自交系和栽培品種混交系為對(duì)照，研究了我國(guó)幾個(gè)主要養(yǎng)殖海帶品種自交系間的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，揭示了自交系內(nèi)部的遺傳差異，分析了親代個(gè)體的

5、純合情況。結(jié)果表明，十個(gè)品系間海帶自交系內(nèi)部高度一致，親本純合度很高。10對(duì)引物共擴(kuò)增出清晰可辨的條帶434條，其中多態(tài)性帶141條，多態(tài)性比率分布在20～40％之間，平均每對(duì)引物組合生成43.4條擴(kuò)增帶，14.1條多態(tài)性帶，平均多態(tài)性檢出比例為32.5％。結(jié)合AFLP圖譜分析可見(jiàn)，煙雜、煙臺(tái)901和青島野生海帶品系的多態(tài)性最高，我國(guó)主要養(yǎng)殖海帶品種可能起源于同一類(lèi)群，有些品系沒(méi)有達(dá)到育種的要求，育種方式還有待改進(jìn)。該研究為今后我國(guó)海帶

6、新品系培育、舊種質(zhì)改良提供了新的思路。 通過(guò)AFLP操作獲得的差異顯示條帶代表著不同海帶品種之間的差別，這些變化主要是海帶養(yǎng)殖過(guò)程中生長(zhǎng)環(huán)境不同而產(chǎn)生的一些可遺傳的變異。欲了解和研究該功能特異性基因，首先要獲得其全長(zhǎng)序列，而RNA的提取和純化是褐藻基因克隆的必由之路。以裙帶菜配子體為材料對(duì)比分析了四種方法，改進(jìn)SDS法、CTAB法、Trizol試劑盒、RNAiso Reagent試劑盒法提取RNA的質(zhì)量和純度，并采用RT-PCR

7、對(duì)mRNA反轉(zhuǎn)錄，對(duì)mRNA的可用性進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，兩種試劑盒Trizol和RNAiso Reagent及其改進(jìn)的方法無(wú)法得到完整的裙帶菜配子體總RNA；CTAB法提取的總RNA條帶清晰完整但有明顯的基因組DNA殘留并有多糖和蛋白質(zhì)污染；改進(jìn)SDS法提取的總RNA三條帶清晰，OD值介于1.8～2.0之間，可應(yīng)用于后續(xù)的RT-PCR實(shí)驗(yàn)，是一種較為理想的裙帶菜等褐藻類(lèi)配子體RNA提取的方法。該方法用于其它大型海藻的總RNA提取，效果