原生質(zhì)體融合構(gòu)建輔酶Q-,10-高產(chǎn)菌株的研究.pdf

1、輔酶Ql0(Coenzyme Q10，簡(jiǎn)寫(xiě)為CoQ10)，又稱泛醌，化學(xué)名稱為2，3-二甲氧基-5-甲基-6-癸異戊烯基-1，4-苯醌。廣泛存在于酵母、植物葉子和種子及動(dòng)物的心臟、肝臟和腎臟中，是細(xì)胞呼吸鏈上的一種遞氫體，是細(xì)胞自身產(chǎn)生的天然抗氧化劑、細(xì)胞代謝激活劑，具有抗氧化性、消除自由基、提高機(jī)體免疫力、抗衰老等功能。廣泛應(yīng)用于各類心臟病、癌癥、急慢性肝炎、帕金森癥等疾病的治療。本文對(duì)根癌土壤桿菌(Agrobacterium tum

2、efaciens)誘變株AT-N10和深紅紅螺菌(Rhodopseudomonas rubrum)1.5005的原生質(zhì)體制備和融合條件進(jìn)行了研究，篩選出一株輔酶Q10產(chǎn)量較高的菌株A-Rh15，以期為進(jìn)一步擴(kuò)大輔酶Q10生產(chǎn)規(guī)模提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和試驗(yàn)指導(dǎo)。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下： (1)分別確定了AT-N10和Rh1.5005的原生質(zhì)體制備和再生適宜條件。根癌土壤桿菌原生質(zhì)體制備和再生的適宜條件：菌齡13.5h；高滲溶液0.8mol

3、/L的NaCl；酶解時(shí)間75min；酶解溫度35℃；溶菌酶濃度0.2mg/ml；深紅紅螺菌原生質(zhì)體制備的和再生適宜條件：菌齡45h；高滲溶液0.5mol/L的蔗糖和0.02mol/L的MgCl2·6H2O：酶解時(shí)間60min；酶解溫度37℃；溶菌酶濃度3mg/L。 (2)確立了AT-N10和Rh1.5005菌株的原生質(zhì)體滅活適宜條件：深紅紅螺菌在60℃滅活20min后，根癌土壤桿菌在55℃分別滅活滅活30min后，在32℃進(jìn)行P

4、EG融合，或進(jìn)行電融合；深紅紅螺菌紫外滅活400s、根癌土壤桿菌紫外滅活320s后，在32℃進(jìn)行PEG融合，或進(jìn)行電融合。 (3)以根癌土壤桿菌AT-N10和深紅紅螺菌Rh1.5005為親本，經(jīng)過(guò)原生質(zhì)體雙親滅活和融合，經(jīng)過(guò)搖管初篩和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩之后，篩選出一株性能比出發(fā)菌株顯著提高的菌株A-Rh15，其輔酶Q10產(chǎn)量15.0278mg/L，較出發(fā)株提高156.46％；每克干細(xì)胞含輔酶Q102.8145 mg,較出發(fā)株提高69.

5、53％。菌株經(jīng)5次和10次傳代培養(yǎng)，輔酶Q10產(chǎn)量分別下降0-3％和0.3％。A-Rh15是一株性狀較穩(wěn)定的優(yōu)良菌株。 (4)應(yīng)用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)和Box-Behnken響應(yīng)面分析方法對(duì)突變株A-Rh15的培養(yǎng)條件進(jìn)行了系統(tǒng)研究，得到了優(yōu)化的培養(yǎng)基組成：酵母膏14.585g、CH3COONa·3H2O1.448g、KH2PO40.802g、NaC10.292g、葡萄糖10g、蛋白胨5g、琥珀酸鈉1g、 Na