計算機輔助設計高活性小分子新型SAHA衍生物及其合成與生物活性評價.pdf

1、背景：組蛋白去乙?；敢种苿?Histone Deacetylase Inhibitors,HDACi)憑借其靶點性強、臨床應用廣泛、治療毒副作用相對較小等眾多優(yōu)勢獲得研究者的關注。多年來大量的臨床試驗結果證明 HDACi對多種癌癥均有顯著的療效,雖然其抗癌作用機理仍未完全明了。但是,通過組蛋白乙?；揎椬饔糜绊懟蜣D錄活性和表達而發(fā)揮作用已經得到很多研究確證。HDACi作用腫瘤細胞后能夠抑制腫瘤細胞中失調高度激活表達的組蛋白去乙?；?/p>

2、(Histone Deacetylases,HDACs),起到提升相應的原抑癌基因的表達水平,從而達到抑制腫瘤細胞無限增值、誘導腫瘤細胞分化、調節(jié)細胞周期檢查和凋亡,導致促進腫瘤細胞死亡?，F(xiàn)今已經有許多 HDACi抗癌藥物投入到了臨床試驗階段上,這些抑制劑中最早通過臨床試驗成功上市的SAHA已被美國所屬的食品藥物管理局(FDA)授權實際應用于臨床各型腫瘤治療以及預防中,但十分讓人感到可惜的是現(xiàn)階段研究的 HDACi絕大多數(shù)為非特異性組蛋

3、白去乙?；敢种苿?nonspecific-HDACi),這就造成了很多臨床治療中出現(xiàn)的副作用,所以導致 HDACi在臨床上的使用也受到了相當大的應用限制。以經典藥物伏立諾他(SAHA)類HDACi的結構為母體結構,結合現(xiàn)代藥物設計方法-計算機輔助藥物設計(Computer-Aided Drug Design,CADD),設計、合成了一系列新型的SAHA類衍生物,對這些衍生物與HDAC酶的作用方式進行了分析比較,并且對其進行了抗腫瘤實驗

4、生物活性評價以及其抗腫瘤的分子機制進行研究和探討。希望通過對SAHA表面結構區(qū)的修飾增加這類抑制劑對HDAC的抑制活性,減少其毒副作用。
　　目的：根據經典的組蛋白去乙?；敢种芐AHA的結構特點和分子對接原理,采用計算機輔助設計小分子 SAHA類衍生物結構,進行化學合成,然后,通過細胞生物實驗,檢測其對HDACs的抑制活性、對腫瘤細胞增殖的抑制作用以及對正常細胞的毒性作用,評價其作用于藥物靶點的能力、抗腫瘤活性和毒性作用。篩選出

5、具有高活性、低毒性的HDACi,并且對其誘導膠質瘤細胞凋亡和自噬的分子機制進行探討。
　　方法：分子對接以HDAC8(PDBcode1T69)為篩選模型對比SAHA使用Autodocking等對接軟件進行SAHA類衍生物-HDAC8酶活性對接。分析對接結果顯示,對接分數(shù)比較高的衍生物在理論上能與 HDAC8酶親和性更強。從而篩選出這些高分衍生物,通過酰胺反應和異羥肟酸結合進行合成。CCK-8的方法考察了這些衍生物對人膠質瘤細胞增殖

6、活性抑制作用以及對正常細胞的毒性作用,篩選濃度在0.1μM到30μM之間,研究細胞株為人膠質瘤細胞MGR2、U373、U251和人正常細胞肝細胞LO2、人正常肺細胞MRC5。使用Elisa方法考察了抑制劑對Beclin-1, Caspase-3,9和Bcl-2活性的影響。通過腹腔注射(I.P.)不同濃度的 HDACi到小鼠體內,在不同時間點取小鼠腦和肺組織經過研磨破碎,通過HPLC測定抑制劑濃度值,確認HDACi是否能到達靶點器官；Bl

7、iss法測定藥物在小鼠中的LD50值,考察抑制劑對小鼠的毒副作用。
　　結果：這些抑制劑在與HDAC8分子對接結果中均比陽性對照SAHA分數(shù)高,理論上與靶點組蛋白去乙酰化酶有更高的親和力；在體外抗膠質腫瘤活性研究實驗檢測結果表明,這些新的SAHA類衍生物均能抑制HDACs和腫瘤細胞增殖,且作用敏感。對比陽性藥物SAHA其中以N3F,N2E,N25為代表化合物對于膠質瘤的治療效果均強于SAHA表現(xiàn)更出色。呈現(xiàn)出對癌細胞高殺傷性,對正

8、常人細胞低毒性的特點。尤其是化合物N3F和N2E表現(xiàn)出色,在U251細胞中N3F的IC50=0.1187μM,正常細胞中毒性低。構效關系研究表明,通過對SAHA表面結構區(qū)進行修飾,能夠增強這些新衍生物對HDAC酶的抑制作用。其中N3F能明顯促進Beclin-1,Caspase-3,9活性,抑制Bcl-2的活性。并且抑制Caspase酶活性后能明提升Beclin-1表達。N25小鼠體內分布研究實驗中發(fā)現(xiàn)N25能穿過血腦屏障順利達到靶點器官

9、(腦)從而發(fā)揮治療效果。而且N25在小鼠的毒性反應實驗中呈較低毒性(LD50：240.840mg/kg)。以上結果表明對SAHA-Cap結構的修改能得到高活性、低毒性的小分子化合物。
　　結論：根據異羥肟酸類結構特點設計、合成新型的SAHA衍生物,研究了其與HDAC8相互作用,并且對化合物結構進行了波普鑒定。針對膠質瘤進行了一系列細胞活性的篩選,選取較為敏感的細胞株進行 HDAC酶活性測定。篩選出活性更高活性的新型 SAHA類構造