基于LDR對高度降解和微量DNA檢材的SNPs分型研究.pdf

1、中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文基于LDR對高度降解和微量DNA檢材的SNPs分型研究姓名：張振申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：法醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：王保捷20080301影子帶(stutter帶)、等位基因丟失等一些難以避免的問題，STR分型結(jié)果通常具有不可重復(fù)性，并難以評價其有效性，無法得到可靠的法醫(yī)學(xué)鑒定結(jié)論。近年來，基于連接酶檢測反應(yīng)(LDR)的SNPs分型技術(shù)快速發(fā)展，為降解檢材和微量檢材的法醫(yī)學(xué)DNA分析提供了新的契機。首先，LDR探針與模板DN

2、A互補結(jié)合的序列不需過長，只要滿足以下兩個條件即可：(1)能夠有效識別待測靶位點，(2)不影響連接酶的識別與結(jié)合所需片段長度，所以，LDR探針長度不超過數(shù)十個堿基。再者，對于雙鏈DNA的單鏈切口，DNA連接酶的識別與連接反應(yīng)具有高度嚴謹性。因此，從理論上說，只要DNA片段不小于30“50bp，即可采用LDR技術(shù)進行SNP分型檢測，這一特性尤其適用于高度降解DNA分析。所以，本文嘗試LDRPCR策略來檢測高度降解DNA。再者，鎖式探針(p

3、adlockprobes)可識別靶位點并形成包含單鏈切E1的局部雙螺旋結(jié)構(gòu)，經(jīng)LDR反應(yīng)可生成環(huán)狀模板，LDR反應(yīng)的高度嚴謹性保證了等位基因識別的準確性；同時，超分支滾環(huán)擴增反應(yīng)具有極強的擴增效能，可極大地放大LDR檢測信號。將二者結(jié)合起來，對LCN檢材的分析效能將得以極大提高。所以，本文擬丌發(fā)LDRHRCA策略來檢測LCN檢材。材料與方法枸櫞酸鈉抗凝人未梢靜脈血樣品12份，男女各6份，由中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)血清學(xué)教研室提供。采用酚

4、一氯仿法提取基因組DNA。分別使用超聲法和DNaseI酶切法處理高分子量基因組DNA，于不同時間段取樣，電泳和／或PCR擴增檢測DNA片段長度，人工制備不超過lOObp的高度降解DNA檢材。使用AmpFlSTR@ldentifiler@PCRAmplificationKit對降解DNA檢材進行復(fù)合STR分型檢驗。選擇4個待測SNPs位點(rsl7750303、rs2307647、rs2307557和rsl7250992)，并構(gòu)建各位點的