接觸DNA檢材提取純化方法的比較及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用.pdf

1、接觸DNA(touch DNA)檢驗是法醫(yī)DNA檢驗的難點和熱點之一。法醫(yī)鑒定中的接觸DNA檢材,是指含有人體皮膚粘膜的脫落細胞的檢材,包括含口腔脫落細胞的檢材、含體表脫落細胞的檢材、人體排泄物或分泌物等。凡是與人體皮膚粘膜接觸過的物品,都可能留下接觸者的脫落細胞。這些留有脫落細胞的物證可以存在于犯罪現(xiàn)場,也可存在于犯罪嫌疑人及被害對象的衣物、用具等客體上。隨著犯罪分子反偵察手段的日益狡猾,明顯的生物物證(精斑、血斑、毛發(fā)、人體組織等)

2、常被有目的地銷毀和破壞,而來自人體的代謝脫落細胞由于微小痕量,常被忽略,如遺留在煙蒂、飲料罐、果核、口香糖上的口腔脫落上皮細胞,遺留在手套、衣物、帽子、指紋上的皮膚脫落上皮細胞,等等。對于這些潛在的微量生物物證,一旦成功地獲得了關(guān)鍵物證的DNA分型,往往就能夠成為案件偵破的關(guān)鍵線索,并為案件定性及法庭量刑提供科學(xué)證據(jù)。
　　 如何從微量接觸檢材中提取到足夠的DNA以滿足法醫(yī)學(xué)檢驗的需要,選擇合適的提取方法非常關(guān)鍵,是法醫(yī)物證檢驗

3、工作者最關(guān)注的難題之一。接觸DNA檢材與常見的生物檢材如血痕、精斑相比,屬于疑難生物檢材。首先,肉眼觀察很難判斷接觸細胞在載體上的具體部位,盲目提取難以獲得所需靶細胞；其次,擦拭面積太大會降低靶DNA的濃度,并帶來外源物質(zhì)的污染和干擾；第三,接觸DNA檢材含有的DNA往往是微量的,屬于低拷貝數(shù)目(Low copy number,LCN)模板,即“DNA含量少于100pg,相當(dāng)于15個雙倍體或30個單倍體細胞的生物樣本”。因此接觸DNA檢

4、驗不同于常規(guī)生物檢材的DNA檢驗,更需系統(tǒng)研究。
　　 目前關(guān)于接觸DNA提取純化方法的文獻很多,概括起來有Chelex法、磁珠法、有機溶劑法(有機法)、過柱法、硅珠法、硅膠膜法等。但多為針對某種方法對某種類型接觸DNA的提取或案例報道,對不同提取純化方法獲得的現(xiàn)場不同類型的接觸DNA的質(zhì)與量的橫向比較缺乏系統(tǒng)研究。本研究采用Quantifiler人類DNA定量試劑盒(AB,USA)實時定量技術(shù)對目前常用的提取純化方法包括Che

5、lex法、磁珠提取法(DNA IQ磁珠法、EQ國產(chǎn)磁珠法)、有機溶劑提取法、Microton過柱法提取的接觸DNA進行定量,同時用Identifiler或Sinofiler復(fù)合擴增系統(tǒng)(AB,USA)擴增,在AB 3130遺傳分析儀上進行STR(short tandemrepeat,短串聯(lián)重復(fù))分型。綜合DNA定量和STR分型結(jié)果,對各種提取純化方法獲得的DNA的質(zhì)和量進行評估和系統(tǒng)比較,以建立有效的接觸DNA提取純化方法。
　　

6、 1.Chelex法提取接觸DNA的實時定量研究
　　 對使用后放置1個月以內(nèi)的30個飲料瓶口或吸管、30個礦泉水瓶(杯)口分別采用不洗滌直接加Chelex-100提取與洗滌+Chelex-100的方法提取DNA,通過PCR定量和STR檢測,比較2種處理方式獲得的DNA平均含量、IPC Ct值、STR檢驗成功率；對使用后放置1個月以內(nèi)的10個新鮮飲料瓶口或吸管,使用后分別放置1個月和放置2個月的20把牙刷、20枚煙蒂,分別采用

7、洗滌+Chelex-100和洗滌+Chelex-100+蛋白酶K(PK)的方法提取DNA,通過PCR定量和STR檢測,比較2種處理方式獲得的DNA平均含量、IPC Ct值、STR檢驗成功率。研究結(jié)果表明,Chelex-100提取前加浸泡洗滌的步驟,可去除部分可溶性雜質(zhì),有利于提高獲得的DNA量和STR檢驗成功率,同時降低反映PCR抑制物存在的IPC Ct值。室溫放置1個月左右的新鮮接觸DNA檢材用Chelex法提取時,是否加蛋白酶K對提

8、取的DNA量和STR檢驗成功率無顯著影響；室溫放置2個月以上的接觸DNA檢材用Chelex法提取時,加蛋白酶K消化后獲得的DNA量和STR檢驗成功率均高于不加蛋白酶K的樣品,差異有顯著性意義。本研究對180份10種實際案件的接觸DNA檢材用Chelex法提取,煙蒂獲得的平均DNA含量最高達175.85 ng,剃須刀較低為7.80 ng。除煙蒂、口香糖采用常規(guī)體系提取外,其它檢材采用小體系提取,平均DNA濃度均在0.2ng/μl以上,采用

9、2 μl模板復(fù)合擴增,除衣服、剃須刀的STR分型成功率較低為50％外,其它檢材的STR分型成功率均在60％以上。
　　 2.磁珠法提取接觸DNA的實時定量研究
　　 對煙蒂、牙刷、手套等3種接觸DNA檢材各10個分別采用95℃裂解液直接裂解、70℃μ裂解液直接裂解和預(yù)消化(TNE+SDS+PK)等3種前處理方式后用DNA IQ磁珠(Promega,USA)提取DNA,測定并比較三種前處理方式后用DNA IQ磁珠法提取獲得

10、的DNA平均含量和IPC Ct值。研究結(jié)果表明,接觸DNA檢材采用先加TNE、SDS、PK等消化,然后再用磁珠純化的方法獲得的DNA量高于單純用裂解液裂解的方法提取的DNA量,有助于提高微量和污染接觸DNA檢材的STR檢驗成功率。但該處理方法操作相對繁瑣,耗時長,除了污染嚴(yán)重的微量接觸DNA檢材外,大部分接觸DNA檢材單純采用直接裂解法就可以獲得足以進行STR分析的DNA。裂解溫度方面,95℃裂解與70℃裂解的DNA獲得量無顯著性差異。

11、對151份8種實際案件的接觸DNA檢材采用95℃直接裂解的DNAIO磁珠法在MaxwellTM 16自動儀上提取DNA。結(jié)果表明除果核平均DNA獲得量為9.51ng以外,其它7種接觸檢材的平均DNA獲得量均大于10ng。采用30μl的小洗脫體積,平均DNA濃度可達0.3ng/μl,采用8N體系3μl模板擴增,檢驗成功率最低的果核也達60％。EQ國產(chǎn)磁珠法與DNA IQ磁珠法相比,不僅價格便宜,還少了1個裂解液洗滌和1個洗滌液洗滌的步驟,

12、操作更為簡單,但對接觸DNA的提取效率無顯著性差異。對138份6種實際案件的接觸DNA檢材在自動化工作站經(jīng)EO國產(chǎn)磁珠法提取DNA,采用8μl體系391模板擴增,除對飲料瓶口的檢驗成功率較低,為60％外,對煙蒂、口香糖、手套等接觸DNA檢材的檢驗成功率也能達到70％以上。因此也適合接觸DNA的提取。
　　 3.5種接觸DNA檢材提取純化方法的比較
　　 將稀釋為10ng、100ng的標(biāo)準(zhǔn)品DNA,分別采用Chelex法、

13、DNA IQ磁珠法、EQ國產(chǎn)磁珠法、有機法、Microton過柱法等5種DNA提取純化方法處理,然后進行PCR定量,比較5種DNA提取純化方法對標(biāo)準(zhǔn)品DNA的回收率。對煙蒂和牙刷2種常見的接觸DNA檢材分別采用Chelex法、95℃直接裂解的DNA IQ磁珠法和EQ國產(chǎn)磁珠法提取DNA,通過PCR定量和STR檢測分析,比較3種提取方法提取的DNA平均含量、IPC Ct值和STR檢驗效果；對30例污染嚴(yán)重的接觸DNA檢材,先用TNE、SD

14、S、PK消化,然后將消化液平均分成2份,1份用DNA IQ磁珠法純化,1份用有機法抽提,通過PCR定量和STR檢測分析,比較磁珠法與有機法對接觸DNA的純化效果:將Chelex法提取的15例5種接觸DNA溶液用Microcon100超濾柱進行純化濃縮,通過PCR定量和STR檢測分析,比較Microcon過柱法濃縮前后的濃度、體積、IPC Ct值及回收率。結(jié)果表明,Chelex法對DNA的提取無損失,磁珠法、有機法、Microcon過柱法

15、對DNA的提取純化均有不同程度的損失。5種提取純化方法對DNA的回收率從高到低大致為Chelex法>Microcon過柱法>DNA IQ磁珠法>EQ國產(chǎn)磁珠法>有機法。Chelex法提取DNA,操作簡單快速,整個提取過程均在一個離心管中進行,避免了DNA在提取過程中的損耗,對污染輕、雜質(zhì)少的接觸DNA檢材,用Chelex法提取最為方便快捷。但Chelex法不能去除DNA溶液中的雜質(zhì)和降解的DNA碎片,因此,Chelex法提取的陳舊接觸檢

16、材的DNA進行STR擴增時,即使模板量在試劑盒推薦的范圍內(nèi),也容易出現(xiàn)等位基因擴增不平衡的現(xiàn)象。磁珠法與Chelex法相比,雖然提取過程中會造成DNA的損失,但提取的DNA純度高,能有效去除100bp以下的DNA小片段和樣品中的色素、蛋白質(zhì)等雜質(zhì),因此,STR擴增時峰高比較均衡,等位基因擴增不平衡的現(xiàn)象不明顯。磁珠法與有機法對接觸DNA的回收量和IPC Ct值雖然無顯著性差異,但磁珠法避免了有機溶劑對操作者的潛在危害,操作簡單,耗時短,

17、因此,更適合微量、污染檢材的DNA提取及自動化操作。Microcon過柱法操作簡單,但對接觸DNA的回收效果不一,100μl的起始體積,過柱濃縮后的體積在8～25μl之間,平均為15μl。過柱后,DNA濃度平均約增加5倍,對DNA的回收率平均為61％,但反映PCR抑制物存在的IPC Ct值無顯著降低。同時,Microcon過柱法的成本也高于磁珠法。因此,Microcon過柱法對接觸DNA的提取純化應(yīng)用有限,只適合污染輕的接觸DNA的純化