建立LCM分離精子細(xì)胞的DNA檢測方法及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用.pdf

1、目的:為了提高混合斑中精子細(xì)胞的檢測成功率，建立一種能夠有效分離混合斑中少量精子細(xì)胞并獲得單一男性DNA分型的分離檢測方法十分必要。本課題旨在建立一種用激光捕獲顯微切割技術(shù)（LCM）分離精子細(xì)胞的DNA 檢測方法；用建立的方法對5個個體的精子DNA 進(jìn)行檢測，以比較這種方法在5個個體間是否有差異；并用建立的方法對低拷貝數(shù)進(jìn)行檢測；對利用LCM分離不同比例混合斑中的精子細(xì)胞并檢測得到單一男性分型的能力進(jìn)行評估，以期讓LCM在強奸案件中發(fā)揮

2、重大的作用。
　　 方法:用LCM 捕獲同一個體的精子細(xì)胞，分為兩組，分別用兩種染色劑（蘇木素和四碘熒光紅）染色，提取和擴增方法一致，捕獲400個精子細(xì)胞，每組進(jìn)行3次平行試驗，對兩種染色劑染色的精子細(xì)胞的基因座檢出率進(jìn)行比較，選擇一種對精子細(xì)胞DNA 檢測影響小的染色劑；用LCM 捕獲蘇木素染色的同一個體的精子細(xì)胞，分為3組，各400個精子細(xì)胞，分別用三種不同的試劑盒（DNA IQTMSystem，QIAamp○R Mini

3、Extraction Kit和PicopureTM DNA Extraction Kit）對精子細(xì)胞進(jìn)行提取，進(jìn)行同樣條件的擴增，每種提取方法進(jìn)行3次平行實驗，通過比較基因座檢出率來選擇一種能夠有效提取LCM分離的精子細(xì)胞DNA的提取方法；用LCM 捕獲5個不同個體的精子細(xì)胞各400個，用建立的染色方法和提取方法及同一種擴增條件對精子DNA 進(jìn)行檢測，比較用建立的方法檢測5個不同個體是否有差異；把標(biāo)準(zhǔn)9947A 稀釋成0.1ng?μL、

4、0.075 ng?μL、0.05ng?μL、0.025ng?μL、0.01ng?μL，分別用28、30、32、34個擴增循環(huán)數(shù)進(jìn)行擴增，得出適合低拷貝數(shù)DNA的擴增循環(huán)數(shù)；利用建立的適合LCM分離精子細(xì)胞的染色和提取方法，并增加循環(huán)數(shù)到34個循環(huán)，對30、20、10、5、4、3個精子細(xì)胞進(jìn)行檢測；人為配制9個不同比例的精子細(xì)胞-陰道上皮細(xì)胞混合液，并涂于玻片上，用LCM分離玻片上混合斑中的精子細(xì)胞（數(shù)量均少于200個）并進(jìn)行DNA檢測，

5、得出檢出率，以評價LCM 技術(shù)方法在分離混合斑中少量精子細(xì)胞并得到單一男性分型的能力。
　　 結(jié)果:蘇木素染色后和四碘熒光紅染色后的基因座檢出率之間的差異明顯具有統(tǒng)計學(xué)意義，用蘇木素染色的精子細(xì)胞提取后可得到全部的基因座分型，而四碘熒光紅染色的精子細(xì)胞未得到任何分型；在3種試劑盒的DNA 提取方法中，DNAIQTM System 試劑盒的提取效果最好；比較檢測的5個個體之間的精子細(xì)胞DNASTR基因座檢出率，統(tǒng)計學(xué)分析用這種方法

6、檢測5個個體精子細(xì)胞DNA的基因座檢出率無明顯差異；用建立的方法對低拷貝數(shù)進(jìn)行檢測，30、20、10、4個精子細(xì)胞可得到全部基因座分型，5個精子細(xì)胞有丟失等位基因現(xiàn)象，3個精子細(xì)胞有丟失等位基因和非特性擴增的現(xiàn)象；用LCM 捕獲9個不同比例的混合斑中的精子細(xì)胞（數(shù)量均﹤200個）并進(jìn)行DNA 檢測，其檢出率為88.9﹪，且均為單一的男性分型。最后將建立的LCM 技術(shù)方法應(yīng)用于實際案例，并取得成功。
　　 結(jié)論:本研究成功建立了一