從成人正常睪丸中分離精子細胞及其cDNA文庫的構建.pdf

1、目的與意義 運用流式細胞術和新型膜滲透性DNA熒光染色劑SYBR-14從人類睪丸中分離單倍體的精子細胞，并構建精子細胞的cDNA文庫，以此來研究人類精子形成的表達譜。為高通量發(fā)現(xiàn)和尋找精子形成相關的新基因，闡明精子形成的分子機制以及尋找基因治療精子形成障礙、免疫避孕、免疫性不孕的診斷新靶位點提供基礎。 材料與方法 標本為成人正常的睪丸。利用物理方法和酶消化制成單細胞懸液；運用改良的非連續(xù)Percoll(15％、22％、30％、

2、40％)密度梯度離心，對精子細胞進行初步的純化及富集；取22％密度層細胞利用流式細胞術對精子細胞進行進一步的分選，根據(jù)細胞物理參數(shù)FSC(forward angle light scatter)、SSC(90°light scatter)從細胞形態(tài)和質地進行分選；再采用SYBR-14／PI熒光染色，通過DNA熒光染色強度差別進行分選。所分選的精子細胞進行巴氏染色細胞形態(tài)學分析、熒光原位雜交(nuoresce in situ hybrid

3、ization，F(xiàn)ISH，X／Y混合探針)和PI染色后DNA含量檢測。所獲取的細胞采用SMART(Switch Mechanism At the 5’end ofRNA Templates)技術建立eDNA文庫。 結果 經(jīng)改良的非連續(xù)percoll(15％、22％、30％、40％)密度梯度離心和流式細胞術分選出高純度的精子細胞，利用細胞形態(tài)學、熒光原位雜交(FISH)、DNA含量分析進行檢測，顯示其純度>90％。分選細胞的SY

4、BR-14的熒光強度顯示為單一峰，但CV>0.08。用所分選的細胞采用SMART技術構建精子細胞cDNA文庫，原始文庫滴度為1.65x10<'6>pfu／ml，重組率為93.27％，擴增文庫滴度為1.1x10<'9>pfu／ml，插入片段大小在0.5-2.0Kb之間，平均長度為1.0Kb。在所構建的成人精子細胞cDNA文庫中成功擴增出精子細胞階段特異性表達的PRM2。 結論：1．從成人正常睪丸中利用流式細胞術分離出純度為92.