小鼠圓形精子、成熟精子細(xì)胞RNA-Seq文庫(kù)的構(gòu)建.pdf

1、小鼠精子增殖分化一步一步的發(fā)育成熟，這個(gè)過(guò)程很復(fù)雜。精原細(xì)胞經(jīng)過(guò)有絲分裂，減數(shù)分裂和圓形精子拉長(zhǎng)變態(tài)，最后形成帶尾巴的成熟精子。精子發(fā)育后期即精子形成階段，圓形精子細(xì)胞經(jīng)過(guò)一系列的生化反應(yīng)和形態(tài)結(jié)構(gòu)變化變成長(zhǎng)形精子細(xì)胞在附睪尾發(fā)育成具有繁殖性能的成熟精子。精子這一系列發(fā)育成熟過(guò)程都和相關(guān)基因的調(diào)控是分不開(kāi)的。精子的過(guò)程可以看到一層層的各種精子細(xì)胞的結(jié)合，支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和其他類(lèi)型的生精細(xì)胞。人們采用不同的分離方法，試圖分離到純度較高的

2、精子細(xì)胞，但總的來(lái)說(shuō)，存在異質(zhì)性的麻煩。為了闡明精子形成過(guò)程中的相關(guān)機(jī)理，篩選出生精細(xì)胞特異表達(dá)的基因勢(shì)在必行。因此分離處于不同發(fā)育階段的單一的、高純度的生殖細(xì)胞群是進(jìn)行相關(guān)研究的首要任務(wù)。
　　 本課題組通過(guò)利用激光顯微切割技術(shù)，從冰凍切片睪丸組織中成功捕獲和分離到約3×104個(gè)小鼠的圓形精子細(xì)胞。同時(shí)用浮游法從小鼠附睪尾收集到了大量成熟的精子。并在此基礎(chǔ)上從分離到的兩種細(xì)胞中提取到了高質(zhì)量的微量總RNA。RNA作為從父本把遺

3、傳信息傳遞到母本的中間載體，在好多方面的過(guò)程中都起著重要作用。作者采用最新發(fā)展起來(lái)的RNA-Seq技術(shù)對(duì)這兩種細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行解析，并在轉(zhuǎn)錄組水平上研究精子形成過(guò)程中的相關(guān)機(jī)理問(wèn)題。但是，由于小鼠精子作為精子發(fā)育成熟的終末最終細(xì)胞，其染色體由于魚(yú)精蛋白的存在而高度濃縮，細(xì)胞核外只有一層細(xì)胞膜，并且細(xì)胞質(zhì)非常少，RNA的含量極少，再加上激光顯微切割所獲得的細(xì)胞量也有限，所獲得的RNA量根本無(wú)法滿(mǎn)足RNA-Seq建庫(kù)的需求，這就為我們的研究

4、提出了一個(gè)挑戰(zhàn)。本研究針對(duì)這一問(wèn)題，我們對(duì)制備的總RNA中的mRNA采用了mRNA線(xiàn)性擴(kuò)增技術(shù)，從而滿(mǎn)足了建庫(kù)所需要的RNA量。mRNA線(xiàn)性擴(kuò)增技術(shù)導(dǎo)致擴(kuò)增偏好型是極細(xì)微的，并且用aRNA進(jìn)行基因表達(dá)研究的可重復(fù)性極高。
　　 本論文首先通過(guò)激光顯微切割技術(shù)和浮游法分別獲得了純凈的圓形精子細(xì)胞、成熟精子，然后通過(guò)對(duì)這兩種細(xì)胞的總RNA進(jìn)行mRNA線(xiàn)性擴(kuò)增達(dá)到了RNA-Seq技術(shù)建庫(kù)所需的RNA量，成功構(gòu)建了這個(gè)兩個(gè)樣品的RNA-