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文檔簡介
1、前言:
法醫(yī)DNA分析技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展,有力地提高了法醫(yī)實踐中個人識別和親子鑒定的能力,已經(jīng)成為法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中最為基本和重要的技術(shù),并且在世界范圍內(nèi)得到廣泛認(rèn)可和應(yīng)用。同樣,DNA分析技術(shù)也面臨著諸多挑戰(zhàn),尤其是在實際檢驗過程中,法醫(yī)鑒定人員有時要面對高度降解的生物學(xué)檢材。
為了解決高度降解DNA檢材的個人識別難題,許多實驗室采用縮短靶DNA片段的擴增子長度這一基本策略,其中最具代表性的就是miniSTR技術(shù)。
2、但是受STR核心重復(fù)序列固有片段長度的限制,大多數(shù)STR基因座的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴增產(chǎn)物長度集中介于100bp~200bp,對于小于100bp的DNA片段,miniSTR技術(shù)尚不能提供足量、可靠的遺傳學(xué)信息。
單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)是指特定核苷酸位置上存在兩種不同的堿基,每種基因型在群體分布頻率不低
3、于1%。由于其多態(tài)性存在于單個堿基上,PCR擴增產(chǎn)物長度能夠大幅縮短,又因其具有分布廣泛,突變率低等特點,SNPs檢測在降解檢材的個人識別中逐漸引起法醫(yī)學(xué)者的重視。
近年來,一種基于連接酶檢測反應(yīng)(ligase detection reaction,LDR)的SNPs分型技術(shù)得到迅速發(fā)展,為解決降解DNA法醫(yī)學(xué)分析難題提供了新的契機。LDR中寡核苷酸探針在設(shè)計時需保證能與靶序列特異性地雜交,并且不能影響后續(xù)的連接反應(yīng),所以
4、對探針長度要求并不是很嚴(yán)格,數(shù)十個核苷酸即能滿足需要;此外,對于雙鏈DNA的單鏈缺口,DNA連接酶的識別和連接反應(yīng)具有高度的嚴(yán)謹(jǐn)性,適合應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)降解檢材的DNA分析上。目前對降解檢材DNA應(yīng)用LDR技術(shù)進(jìn)行分析只能實現(xiàn)對4個SNPs位點的復(fù)合分型,尚不能滿足法醫(yī)學(xué)個人識別的要求。因此,本研究嘗試構(gòu)建一套基于LDR的熒光標(biāo)記PCR復(fù)合擴增體系,能夠?qū)崿F(xiàn)對8個SNPs位點進(jìn)行分型檢測,提高其法醫(yī)學(xué)個人識別力,同時探討對福爾馬林固定石蠟包
5、埋組織(Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissues,F(xiàn)FPET)中降解DNA的分型的可行性,為解決高度降解DNA法醫(yī)學(xué)分析難題提供新的策略。
材料和方法:
1、中國北方地區(qū)漢族個體末梢靜脈血樣,枸櫞酸鈉抗凝;選取一具冰凍尸體的腦、肺、心肌、腎和肝組織塊按常規(guī)方法制作FFPET,同時取尸體心腔血液作為陽性對照。
2、酚/氯仿法提取血液DNA,二甲苯脫蠟
6、法和Chelex-100法提取FFPET檢材DNA。
3、選擇8個SNPs位點(rs10802248、rs10516197、rs10488372、rs2278945、rs4757318、rs4887255、rs4889002和rs9304473),設(shè)計合成SNPs位點的LDR探針和連接產(chǎn)物PCR引物,通過連接酶檢測反應(yīng),PCR擴增和毛細(xì)管凝膠電泳(capillary gel electrophoresis,CGE),構(gòu)建復(fù)
7、合擴增SNPs分型體系。
4、對FFPET檢材降解DNA分別進(jìn)行AmpF(l)STR(R) Identifiler(R) PCRAmplification Kit分型檢測和熒光標(biāo)記LDR-PCR復(fù)合擴增檢測,對兩者分型結(jié)果進(jìn)行比較。
結(jié)果:
1、經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定3天后所有的FFPET的DNA即發(fā)生明顯的降解。隨著固定時間的延長,降解程度逐漸加劇,并且不同組織類型的降解速率呈現(xiàn)出明顯差
8、異。15天后腦FFPET檢材DNA片段降解到lkbp以下,心肌FFPET檢材DNA在500bp以下,肺臟和腎臟FFPET檢材DNA在200bp以下,肝臟FFPET檢材DNA在100bp以下。
2、本研究使用熒光標(biāo)記LDR-PCR復(fù)合擴增方法,對不同個體的8個SNPs位點進(jìn)行一次性分型,每個SNP位點純合子為單一產(chǎn)物峰,雜合子為長度相差2bp的兩個產(chǎn)物峰,對于擴增產(chǎn)物長度有所重疊著,由于使用不同的熒光標(biāo)記物,能完全實現(xiàn)正確分
9、型。對所有的檢測個體的8個SNPs位點進(jìn)行常規(guī)PCR擴增并測序,測序結(jié)果與LDR-PCR分型結(jié)果完全一致。
3、對于FFPET檢材高度降解DNA檢材,熒光標(biāo)記LDR-PCR復(fù)合擴增體系能夠?qū)崿F(xiàn)8個SNPs位點的準(zhǔn)確分型,AmpF(l)STR(R) Identifile(R) PCR AmplificationKit則無法提供全部15個STR分型結(jié)果。
結(jié)論:
1、熒光標(biāo)記LDR-PCR復(fù)合擴增方
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