熒光標(biāo)記LDR-PCR復(fù)合擴增方法對高度降解DNA檢材的SNPs分型研究.pdf

1、前言：
　　 法醫(yī)DNA分析技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展，有力地提高了法醫(yī)實踐中個人識別和親子鑒定的能力，已經(jīng)成為法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中最為基本和重要的技術(shù)，并且在世界范圍內(nèi)得到廣泛認(rèn)可和應(yīng)用。同樣，DNA分析技術(shù)也面臨著諸多挑戰(zhàn)，尤其是在實際檢驗過程中，法醫(yī)鑒定人員有時要面對高度降解的生物學(xué)檢材。
　　 為了解決高度降解DNA檢材的個人識別難題，許多實驗室采用縮短靶DNA片段的擴增子長度這一基本策略，其中最具代表性的就是miniSTR技術(shù)。

2、但是受STR核心重復(fù)序列固有片段長度的限制，大多數(shù)STR基因座的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴增產(chǎn)物長度集中介于100bp～200bp，對于小于100bp的DNA片段，miniSTR技術(shù)尚不能提供足量、可靠的遺傳學(xué)信息。
　　 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）是指特定核苷酸位置上存在兩種不同的堿基，每種基因型在群體分布頻率不低

3、于1％。由于其多態(tài)性存在于單個堿基上，PCR擴增產(chǎn)物長度能夠大幅縮短，又因其具有分布廣泛，突變率低等特點，SNPs檢測在降解檢材的個人識別中逐漸引起法醫(yī)學(xué)者的重視。
　　 近年來，一種基于連接酶檢測反應(yīng)(ligase detection reaction，LDR)的SNPs分型技術(shù)得到迅速發(fā)展，為解決降解DNA法醫(yī)學(xué)分析難題提供了新的契機。LDR中寡核苷酸探針在設(shè)計時需保證能與靶序列特異性地雜交，并且不能影響后續(xù)的連接反應(yīng)，所以

4、對探針長度要求并不是很嚴(yán)格，數(shù)十個核苷酸即能滿足需要;此外，對于雙鏈DNA的單鏈缺口，DNA連接酶的識別和連接反應(yīng)具有高度的嚴(yán)謹(jǐn)性，適合應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)降解檢材的DNA分析上。目前對降解檢材DNA應(yīng)用LDR技術(shù)進(jìn)行分析只能實現(xiàn)對4個SNPs位點的復(fù)合分型，尚不能滿足法醫(yī)學(xué)個人識別的要求。因此，本研究嘗試構(gòu)建一套基于LDR的熒光標(biāo)記PCR復(fù)合擴增體系，能夠?qū)崿F(xiàn)對8個SNPs位點進(jìn)行分型檢測，提高其法醫(yī)學(xué)個人識別力，同時探討對福爾馬林固定石蠟包

5、埋組織(Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissues，F(xiàn)FPET)中降解DNA的分型的可行性，為解決高度降解DNA法醫(yī)學(xué)分析難題提供新的策略。
　　 材料和方法：
　　 1、中國北方地區(qū)漢族個體末梢靜脈血樣，枸櫞酸鈉抗凝;選取一具冰凍尸體的腦、肺、心肌、腎和肝組織塊按常規(guī)方法制作FFPET，同時取尸體心腔血液作為陽性對照。
　　 2、酚/氯仿法提取血液DNA，二甲苯脫蠟

6、法和Chelex-100法提取FFPET檢材DNA。
　　 3、選擇8個SNPs位點(rs10802248、rs10516197、rs10488372、rs2278945、rs4757318、rs4887255、rs4889002和rs9304473)，設(shè)計合成SNPs位點的LDR探針和連接產(chǎn)物PCR引物，通過連接酶檢測反應(yīng)，PCR擴增和毛細(xì)管凝膠電泳(capillary gel electrophoresis，CGE)，構(gòu)建復(fù)

7、合擴增SNPs分型體系。
　　 4、對FFPET檢材降解DNA分別進(jìn)行AmpF(l)STR(R) Identifiler(R) PCRAmplification Kit分型檢測和熒光標(biāo)記LDR-PCR復(fù)合擴增檢測，對兩者分型結(jié)果進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果：
　　 1、經(jīng)10％中性福爾馬林溶液固定3天后所有的FFPET的DNA即發(fā)生明顯的降解。隨著固定時間的延長，降解程度逐漸加劇，并且不同組織類型的降解速率呈現(xiàn)出明顯差

8、異。15天后腦FFPET檢材DNA片段降解到lkbp以下，心肌FFPET檢材DNA在500bp以下，肺臟和腎臟FFPET檢材DNA在200bp以下，肝臟FFPET檢材DNA在100bp以下。
　　 2、本研究使用熒光標(biāo)記LDR-PCR復(fù)合擴增方法，對不同個體的8個SNPs位點進(jìn)行一次性分型，每個SNP位點純合子為單一產(chǎn)物峰，雜合子為長度相差2bp的兩個產(chǎn)物峰，對于擴增產(chǎn)物長度有所重疊著，由于使用不同的熒光標(biāo)記物，能完全實現(xiàn)正確分

9、型。對所有的檢測個體的8個SNPs位點進(jìn)行常規(guī)PCR擴增并測序，測序結(jié)果與LDR-PCR分型結(jié)果完全一致。
　　 3、對于FFPET檢材高度降解DNA檢材，熒光標(biāo)記LDR-PCR復(fù)合擴增體系能夠?qū)崿F(xiàn)8個SNPs位點的準(zhǔn)確分型，AmpF(l)STR(R) Identifile(R) PCR AmplificationKit則無法提供全部15個STR分型結(jié)果。
　　 結(jié)論：
　　 1、熒光標(biāo)記LDR-PCR復(fù)合擴增方