熒光標(biāo)記公用引物片段長度差異復(fù)合擴(kuò)增21個SNPs位點(diǎn)的多態(tài)性及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用的研究.pdf

1、單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)是指基因組內(nèi)特定核苷酸位置上存在著兩種不同等位基因，其中最少的一種在群體中的頻率不少于1％。單核苷酸多態(tài)性因其占人類基因組中多態(tài)性的90%以上而受到廣泛關(guān)注。其特點(diǎn)包括以下幾點(diǎn)：首先，位點(diǎn)豐富。SNP分布于整個基因組，據(jù)估計，基因組中大約平均每1000bp就會出現(xiàn)1個SNP，從而使其在整個基因組的分布可達(dá)300萬之多。其次，突變率低，每代每堿基突變率

2、約為2×10-8。尤其是位于編碼區(qū)的SNP(coding region SNP，cSNP)，呈高度穩(wěn)定性。第三，SNPs位點(diǎn)為單堿基變異，可分析片段短小，更適合PCR擴(kuò)增及降解DNA的分析。第四，SNPs適于快速、高通量檢出。其二態(tài)變異，易于判型，有利于發(fā)展自動化的篩選或檢測技術(shù)。第五，SNPs多態(tài)性在不同人種和/或群體中的分布有所不同，可用于人類遺傳學(xué)、疾病相關(guān)性及法醫(yī)學(xué)研究。
　　 由于SNPs具有上述特點(diǎn)，不僅很快成為醫(yī)學(xué)

3、、藥學(xué)、臨床診斷學(xué)的研究熱點(diǎn)，而且在法庭科學(xué)生物物證鑒定領(lǐng)域，尤其在解決降解生物檢材個體識別方面也引起學(xué)者們的極大關(guān)注。在法庭科學(xué)生物物證鑒定領(lǐng)域中，對于保存條件較好，DNA分子比較完整的生物檢材，應(yīng)用現(xiàn)有的DNA分析技術(shù)都能較好的解決。但是，對于保存條件差，DNA分子不完整的降解生物檢材尚不能有效解決，這也是當(dāng)前面臨的難題之一。SNP可分析片段短小，更適合降解DNA的分析，因此通過積極開展相關(guān)研究，有可能建立一種行之有效的適合這類檢材

4、分析的新技術(shù)手段。
　　 SNPs位點(diǎn)突變率低，遺傳穩(wěn)定，也是分析人類起源、遷移等比較理想的遺傳標(biāo)記。Sanchez JJ等對索馬里、土耳其、丹麥、德國、格陵蘭、日本、泰國、臺灣和中國大陸9個地區(qū)700名無關(guān)個體的52個SNPs位點(diǎn)進(jìn)行分析，通過計算不同種族和民族間的遺傳距離，認(rèn)為亞洲人群中臺灣和大陸人群關(guān)系最近，其次是二者與泰國人群的關(guān)系，再次為與日本人群的關(guān)系；研究表明所調(diào)查的亞洲人群與其它人群的關(guān)系較遠(yuǎn)，從近到遠(yuǎn)依次為格陵

5、蘭、德國、丹麥、土耳其，最遠(yuǎn)的為索馬里?？略胶５韧ㄟ^對中國各地9988例男性隨機(jī)樣本Y染色體M89，M130和YAP3個單倍型分析，認(rèn)為Y染色體的證據(jù)支持現(xiàn)代中國人起源非洲假說。劉烜等對我國貴州地區(qū)布依族、仡佬族、仫佬族、毛南族、壯族5個少數(shù)民族10個SNPs構(gòu)成的Y染色體單倍型分析，認(rèn)為這5個民族之間遺傳關(guān)系密切，與國內(nèi)其他民族有較大的遺傳差異，是相對獨(dú)立的群體。
　　 雖然目前分析SNP的方法有多種，但普遍存在兩個方面問題。

6、一是，一些無需專用SNP分析設(shè)備的方法，如RFLP、SSCP方法，或者是檢測通量低，一次只能檢測出單個SNP位點(diǎn)，獲得的信息量少，或者是實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，檢測過程費(fèi)時，如SNaPshot，均不適合法庭科學(xué)領(lǐng)域的高通量檢測需求；二是，另一些操作簡單檢測通量高的方法均需要借助昂貴的SNP分析專項(xiàng)設(shè)備和配套試劑實(shí)現(xiàn)，不利于方法本身的推廣，例如DHPLC、基因芯片法、MALDI-TOF MS等方法。
　　 為解決法庭科學(xué)生物物證鑒定領(lǐng)域降解

7、生物檢材的鑒定問題，了解多位點(diǎn)SNPs在中國不同民族人類遺傳學(xué)、法醫(yī)學(xué)意義并解決現(xiàn)有SNP分析技術(shù)的瓶頸問題，本研究結(jié)合當(dāng)前法庭科學(xué)實(shí)驗(yàn)室普遍采用熒光標(biāo)記和毛細(xì)管電泳分離技術(shù)的實(shí)際情況，開展了具有普遍適用性的基于毛細(xì)管電泳分離技術(shù)的熒光標(biāo)記多位點(diǎn)SNP分型技術(shù)研究，旨在建立一種高效率、低成本、快速準(zhǔn)確的多位點(diǎn)SNP分型技術(shù)。并通過調(diào)查常染色體更多SNPs位點(diǎn)在中國不同民族中基因頻率調(diào)查，以了解SNPs在中國不同民族中的分布狀態(tài)，在此基礎(chǔ)

8、上進(jìn)一步分析不同民族間的遺傳關(guān)系，并根據(jù)調(diào)查結(jié)果評估復(fù)合擴(kuò)增21個SNPs在法庭科學(xué)中的應(yīng)用價值。
　　 材料與方法
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 1、中國漢、蒙、壯三個民族的血痕樣本
　　 遼寧地區(qū)漢族健康無關(guān)個體血痕樣品203份；內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙古族健康無關(guān)個體血痕樣品152份；廣西壯族自治區(qū)壯族健康無關(guān)個體血痕樣品184份。
　　 2、靈敏度測定樣品：干血濾紙一份，來自本實(shí)驗(yàn)室。
　　 3

9、、DnaseI降解實(shí)驗(yàn)樣品：新鮮血液約2ml，來自本實(shí)驗(yàn)室健康自愿者。
　　 4、親子關(guān)系分析樣品：為10個待確認(rèn)的父-子-母三聯(lián)體共30份干血濾紙，來自本實(shí)驗(yàn)室日常實(shí)際案例。
　　 5、組織同一性分析樣品：為同一個體不同組織的心、肝、脾、肺、腎、肌肉及大腦7份組織，來自本實(shí)驗(yàn)室。
　　 6、實(shí)際案件中樣品：20份血痕、10份肌肉、15枚煙蒂，10份軟骨，8份性犯罪混合斑，來自日常案件積累。
　　 二、實(shí)

10、驗(yàn)方法
　　 (一)建立熒光標(biāo)記公用引物片段長度差異SNPs復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)
　　 1、SNP位點(diǎn)篩選
　　 根據(jù)http：//www.hapmap.org網(wǎng)站，從1-22號染色體中篩選45個SNPs位點(diǎn)作為備選。
　　 2、SNP位點(diǎn)引物設(shè)計、合成
　　 根據(jù)熒光標(biāo)記公用引物和等位基因特異性引物原理，同時在特異性引物序列引入錯配的堿基，構(gòu)建多位點(diǎn)SNPs復(fù)合擴(kuò)增引物體系，應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)

11、計引物。SNP特異性引物送上海生工生物公司合成，熒光標(biāo)記公用引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。
　　 3、建立SNPs復(fù)合擴(kuò)增體系
　　 經(jīng)單位點(diǎn)、分小組、合并組逐級擴(kuò)大PCR擴(kuò)增，層層淘汰不合格引物，篩選出可以進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增的SNPs位點(diǎn)。
　　 4、SNPs復(fù)合擴(kuò)增體系的優(yōu)化
　　 對起關(guān)鍵作用的引物退火溫度、不同位點(diǎn)間引物濃度配比及DNA聚合酶等重要因素進(jìn)行優(yōu)化，以完善復(fù)合擴(kuò)增體系。
　　

12、 5、SNPs分型結(jié)果的測序驗(yàn)證
　　 針對每個SNP位點(diǎn)重新設(shè)計兩條測序引物，擴(kuò)增包含SNP位點(diǎn)在內(nèi)的序列，精制模板后單向測序，驗(yàn)證SNP分型結(jié)果的準(zhǔn)確性。
　　 (二)調(diào)查3個民族21個SNPs位點(diǎn)基因頻率分布及法醫(yī)學(xué)意義評價
　　 采用本研究建立的SNPs復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)，對我國遼寧地區(qū)漢族、內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族和廣西地區(qū)壯族人群進(jìn)行基因頻率調(diào)查，并對3個民族21個SNPs位點(diǎn)等位基因頻率分布進(jìn)行Hardy-Wei

13、nberg平衡檢驗(yàn)；通過X2檢驗(yàn)對3個民族21個SNPs位點(diǎn)的基因分布進(jìn)行比較分析；通過聚類分析方法分析三個民族間的遺傳關(guān)系；根據(jù)3個民族的調(diào)查結(jié)果，計算各民族21個SNPs位點(diǎn)的雜合度、多態(tài)信息總量、個人識別幾率和非父排除率，以評估21個SNPs位點(diǎn)復(fù)合擴(kuò)增的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值。
　　 (三)熒光標(biāo)記公用引物片段長度差異21個SNPs復(fù)合擴(kuò)增的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用
　　 應(yīng)用本研究建立的復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)，對DNA最小檢出量、組織同一性、

14、21個位點(diǎn)的遺傳穩(wěn)定性以及不同種類生物檢材的檢驗(yàn)有效性進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。為了解本方法對降解生物檢材的檢測能力，使用Dnasel進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)，并與STR檢測結(jié)果進(jìn)行平行比較。用21個SNPs復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)和AmpF1STRTMSinofiler STRs檢測試劑盒，對10個待確認(rèn)親子關(guān)系的父-母-子三聯(lián)體案例同時進(jìn)行親權(quán)鑒定，通過結(jié)果比較，探討本方法在法醫(yī)學(xué)個人識別和親子鑒定的可靠性和實(shí)用性。
　　 結(jié)果與討論
　　 一、熒光

15、標(biāo)記片段長度差異21個SNPs復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)的建立
　　 本研究建立的SNPs復(fù)合擴(kuò)增基本原理：每個SNP位點(diǎn)有三條擴(kuò)增引物，兩條上游、一條下游引物，每條引物由特異性序列和公用尾部序列兩部分構(gòu)成。上游引物的3’末端堿基分別與SNP位點(diǎn)的兩個等位基因?qū)?yīng)，并且在距3’末端的第3位堿基處分別引入一個錯配堿基，以提高PCR擴(kuò)增特異性。公用尾部序列有三種(Uni1，Uni2和Uni3)，上游引物中的一條連接公用尾部序列Uni1，另一條連接

16、公用尾部序列Uni2，下游引物連接公用尾部序列Uni3。
　　 公用引物有U1、U2、U3三條，U1和U2分別用熒光標(biāo)記物HEX(綠色)和6-FAM(藍(lán)色)標(biāo)記。以利于基因型判定。
　　 本研究復(fù)合擴(kuò)增體系建立采用分階段分組完成。首先，進(jìn)行單位點(diǎn)擴(kuò)增，淘汰不合格位點(diǎn)；其次，分小組復(fù)合擴(kuò)增，每組約5個位點(diǎn)引物，刪除不合格位點(diǎn)；再次，合并小組，每組各10-11個SNPs位點(diǎn)，進(jìn)一步淘汰不合格位點(diǎn)；最后，將所有合格的位點(diǎn)合并成

17、一組，進(jìn)一步淘汰不合格擴(kuò)增位點(diǎn)。經(jīng)過逐級擴(kuò)大、層層淘汰，最終確定了21個SNPs位點(diǎn)復(fù)合擴(kuò)增體系。在此復(fù)合擴(kuò)增體系中又加入了用于性別鑒定的Amelogenin基因的擴(kuò)增引物。
　　 本研究建立的SNPs復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)對21個常染色體SNPs位點(diǎn)和人牙釉質(zhì)蛋白Amelogenin基因一次性單管擴(kuò)增，經(jīng)毛細(xì)管電泳后，每個SNPs位點(diǎn)純合子為單一產(chǎn)物峰，雜合子為兩個片段長度相同，呈現(xiàn)藍(lán)、綠兩種染色的產(chǎn)物峰，可以正確區(qū)分并判定基因型。隨機(jī)

18、選取6份用本研究方法分型的樣品，對每個SNP位點(diǎn)逐一測序驗(yàn)證。結(jié)果顯示，6份樣品熒光標(biāo)記SNPs復(fù)合擴(kuò)增分型結(jié)果與直接測序結(jié)果完全一致，證明本方法結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，是一種快速、簡單、高效且較為實(shí)用的SNPs分型新方法，適用于大樣本量的多位點(diǎn)SNPs的同步分型。
　　 二、我國3個民族21個SNPs位點(diǎn)的基因分布
　　 調(diào)查結(jié)果顯示，21個SNPs位點(diǎn)等位基因在遼寧地區(qū)漢族、內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族、廣西地區(qū)壯族3個民族群體中均具有

19、多態(tài)性。Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)顯示，X2值分別在0.001-1.617、0.002-1.65和0.005-1.53之間，P值均大于0.05，符合Hardy-Weinberg平衡，表明選取的三個群體樣本具有代表性。
　　 我國3個民族21個SNPs位點(diǎn)基因頻率的比較結(jié)果表明：在遼寧漢族和內(nèi)蒙古蒙古族之間，有2個SNPs位點(diǎn)rs1014440、rs1010870的基因多態(tài)性分布呈極顯著差異(P≤0.001)，1個位點(diǎn)r

20、s1022690有差異(P≤0.05)，其余18個SNPs位點(diǎn)的基因分布沒有差異(P≥0.05)；在遼寧漢族和廣西壯族之間，5個SNPs位點(diǎn)rs10003686、rs1022106、rs116187、rs1014440和rs1010870的基因分布有極顯著差異(P≤0.001)，7個位點(diǎn)rs10005781、rs1024283、rs1001389、rs101570、rs10519137、rs1018427和rs112603(P≤0.05

21、)有差異，其余9個位點(diǎn)沒有差異(P≥0.05)；在內(nèi)蒙古蒙古族和廣西壯族之間，3個SNPs位點(diǎn)rs1022106、rs116187和rs1014440的基因分布有極顯著差異(P≤0.001)，3個位點(diǎn)rs10003686、rs1024283和rs1001389有差異(P≤0.05)，其余15個位點(diǎn)的基因分布沒有差異(P≥0.05)，由此可見，三個民族在多個SNPs位點(diǎn)上的等位基因分布具有顯著性差異。
　　 本研究采用歐氏距離平方

22、法對3個民族21個SNPs位點(diǎn)共126個等位基因頻率的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示，遼寧漢族與內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族之間的歐氏不相似系數(shù)最小，為0.348；內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族與廣西地區(qū)壯族之間的歐氏不相似系數(shù)次之，為0.415；遼寧地區(qū)漢族與廣西地區(qū)壯族之間的歐氏不相似系數(shù)最大，為0.647。說明遼寧地區(qū)漢族與內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族的親緣關(guān)系比遼寧地區(qū)漢族與廣西地區(qū)壯族的親緣關(guān)系更近。
　　 根據(jù)21個SNPs位點(diǎn)在遼寧地區(qū)漢族、內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古

23、族和廣西地區(qū)壯族的等位基因頻率調(diào)查結(jié)果，計算出各位點(diǎn)在不同民族的多態(tài)性信息量(PIC)、雜合度(H)、個人識別幾率(Dp)和非父排除率(PE)。
　　 遼寧漢族群體的21個SNPs位點(diǎn)多態(tài)信息總量在0.25-0.5之間。雜合度最大的是rs1007469和rs116187位點(diǎn)，均為0.5320，最小的是rs1010870位點(diǎn)，為0.3547；個人識別幾率最大的是rs101570位點(diǎn)，為0.6374，最小的是rs1010870位點(diǎn)，

24、為0.5056；非父排除率最大的是rs1003416，為0.1875，最小的是rs1010870位點(diǎn)，為0.1409；21個SNPs位點(diǎn)累積個人識別幾率為0.999999997，累積非父排除率為0.984769502。
　　 內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族群體的多態(tài)信息總量位于0.25-0.5之間。雜合度最大的是rs10005781，為0.5461，最小的是rs112603位點(diǎn)，為0.3487；個人識別幾率最大的是rs101570位點(diǎn)，為0.

25、6269，最小的是rs112603位點(diǎn)，為0.5314；非父排除率最大的是rs10005781和rs1010870，均為0.1874，最小的是rs112603位點(diǎn)，為0.1491；21個SNPs位點(diǎn)累積個人識別幾率為0.999999996，累積非父排除率為0.984646。
　　 廣西地區(qū)壯族群體的多態(tài)信息總量均位于0.25-0.5之間。雜合度最大的是rs1010870位點(diǎn)，為0.5272，最小的是rs10003686位點(diǎn)，為0

26、.3587；個人識別幾率最大的是rs1018427位點(diǎn)，為0.6419，最小的是rs10003686位點(diǎn)，為0.4998；非父排除率最大的是rs1001389和rs1018427，均為0.1875，最小的是rs10003686位點(diǎn)，為0.1391；21個SNPs位點(diǎn)累積個人識別幾率為0.999999995，累積非父排除率為0.98236771。
　　 以上數(shù)據(jù)表明，本研究選擇的21個SNPs位點(diǎn)在中國遼寧地區(qū)漢族、內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古

27、族、廣西地區(qū)壯族3個民族中具有較好的多態(tài)性分布，聯(lián)合使用這21個SNPs位點(diǎn)遺傳標(biāo)記的累積個人識別幾率和累積非父排除率均分別達(dá)到99.999999%和98％以上。因此認(rèn)為，應(yīng)用本研究建立的熒光標(biāo)記公用引物片段長度差異復(fù)合擴(kuò)增體系，進(jìn)行21個SNPs遺傳標(biāo)記的基因分型，在法醫(yī)學(xué)個人識別和親子鑒定中具有較高的系統(tǒng)效能和應(yīng)用價值。
　　 三、熒光標(biāo)記SNPs復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究
　　 本研究對所建立的方法，進(jìn)行了在法庭

28、科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用前的有效性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，包括靈敏度、組織同一性、遺傳穩(wěn)定性及不同種類生物性檢材的檢驗(yàn)。同時，為了解此方法對降解生物檢材的分析能力，利用DnaseI進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)，并與STR復(fù)合擴(kuò)增方法進(jìn)行了平行比較。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，21個SNPs位點(diǎn)的復(fù)合擴(kuò)增體系檢測的最低檢測限為125pg；來自同一個體心、肝、脾、肺、腎、肌肉、大腦7種不同組織的21個SNPs位點(diǎn)及Amelogenin位點(diǎn)分型一致，證明本研究建立的方法比較靈敏，具

29、有穩(wěn)定性。
　　 對63份日常實(shí)際案件中血痕、肌肉、煙蒂、軟骨及混合斑檢材進(jìn)行分析，均獲得滿意的分型結(jié)果。表明本研究方法對常見生物檢材同樣具有良好的適用性。
　　 將本研究建立的方法應(yīng)用于兩起刑事案件，獲得的同一比對結(jié)果得到了AmpF1STRTM Sinofiler試劑盒STR分型結(jié)果的進(jìn)一步支持。證明本研究建立的方法可以進(jìn)行生物性檢材的同一比對。
　　 本研究對經(jīng)DnaseI瞬時和5分鐘降解的DNA樣品進(jìn)行分析

30、，并使用AmpF1STRTMSinofiler試劑盒和AmpF1STRTM MiniFilerTM試劑盒進(jìn)行平行比較，結(jié)果表明，應(yīng)用本研究建立的21個SNPs位點(diǎn)的復(fù)合擴(kuò)增體系比常規(guī)STR試劑盒及MiniSTR試劑盒具有更高的檢測成功率。
　　 對10個待確認(rèn)親子關(guān)系的二代三聯(lián)體的分析結(jié)果顯示：21個SNPs位點(diǎn)均未發(fā)現(xiàn)變異，10個案例均未排除生物學(xué)親子關(guān)系。同時采用AmpF1STRTM Sinofiler試劑盒檢驗(yàn)15個STR

31、位點(diǎn)作為對照，所得結(jié)論與SNPs檢測結(jié)果一致。說明本研究建立的21個SNPs位點(diǎn)復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)可以應(yīng)用于親子鑒定。
　　 綜上所述，本研究建立的熒光標(biāo)記片段長度差異21個SNPs位點(diǎn)復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)，可以應(yīng)用于人類遺傳學(xué)、疾病相關(guān)性研究以及法醫(yī)學(xué)個人識別和親子鑒定。
　　 結(jié)論
　　 1、本研究建立的熒光標(biāo)記公用引物片段長度差異SNPs復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，是一種簡單、快速、有效且實(shí)用的又一種SNP多態(tài)性分析方

32、法，可用于21個SNPs基因的同步分型。
　　 2、我國遼寧地區(qū)漢族、內(nèi)蒙古蒙古族和廣西壯族21個SNPs位點(diǎn)的等位基因分布具有多態(tài)性。抽樣調(diào)查符合Hardy-Weinberg平衡。
　　 3、21個SNPs位點(diǎn)在三個民族中有多個位點(diǎn)的等位基因頻率具有顯著性差異(P≤0.01)。遼寧地區(qū)漢族與內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族的親緣關(guān)系更為接近，與廣西地區(qū)壯族的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　 4、熒光標(biāo)記公用引物片段長度差異復(fù)合擴(kuò)增21個S