應用末端限制性片段長度多態(tài)性技術對骨科感染中細菌群落的解析.pdf

1、感染是骨科臨床實踐中重點關注的問題之一，無論是假體相關性感染還是諸如開放性骨折、慢性骨髓炎等其它骨科感染，往往具有病原學復雜，抗生素耐藥等問題，而對諸如“無菌性假體”松動這樣的臨床診斷中到底有無細菌的存在更是莫衷一是，爭議頗多。臨床傳統(tǒng)應用的微生物純培養(yǎng)方法對于這些問題的回答力有未逮。脫胎于環(huán)境工程學科的分子生物學技術末端限制性片段長度多態(tài)性（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphi

2、sm，T-RFLP）通過對系統(tǒng)中微生物的標記DNA-16S rDNA-的檢測，獲取許多長度不同的末端限制性片段（Terminal Restriction Fragment，T-RF）或稱分類操作單元（Operational
　　 Taxonomic Unit，OTU），從而可以全景式的解析系統(tǒng)中所有細菌群落的結構，這尤其對于檢測那些臨床傳統(tǒng)方法不能培養(yǎng)的細菌意義重大。近年來T-RFLP方法正被逐漸應用于臨床病原菌的檢測，例如腸道

3、菌群、陰道菌群等，但應用于骨科感染的研究尚未見報道。
　　 研究目的：
　　 1.應用 T-RFLP技術分析懷疑感染的骨科標本中細菌群落分布情況；
　　 2.比較T-RFLP技術得到的結果與臨床傳統(tǒng)純培養(yǎng)結果的異同；
　　 3.初步評價該技術的優(yōu)缺點及其應用于臨床的前景。
　　 研究方法：
　　 1.實驗對象：骨科感染標本（包括假體相關性和非假體相關性），其它科感染標本；
　　 2

4、.細菌檢測方法：T-RFLP，臨床純培養(yǎng)；
　　 3.分析方法：
　　 i.對T-RFLP自身結果進行聚類分析；
　　 ii.對兩者的比較則應用克隆文庫測序、TAP（T-RFLP AnalysisProgram）和臨床結果電子酶切的方法。
　　 研究結果：
　　 1.收集了59份臨床樣品，最終14份得到了T-RFLP譜圖；
　　 2.聚類分析顯示，樣品可按照解剖部位分類，每類中末端限制性片

5、段（T-RFs）的分布具有一般性規(guī)律：其中膝關節(jié)樣品6、11、12、17中豐度最高的片段都是80bp、82bp、85bp，其總豐度超過40％；脊椎樣品30、47中豐度最高的片段都是479bp，總豐度超過60％；
　　 3.對13號樣品構建了克隆文庫并測序，Blast分析（Basic Local AlignmentSearch Tool），序列結果為停乳鏈球菌，與臨床培養(yǎng)結果一致；
　　 4.臨床已知培養(yǎng)結果者電子酶切分析

6、得到的 T-RFs大多與 T-RFLP實測情況相符（為豐度最多的片段，且兩者相差在1～3bp）。
　　 結論：
　　 本研究應用末端限制性片段長度多態(tài)性技術對骨科感染標本中細菌群落結構的分布進行了全景式的掃描分析，并同臨床傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法進行了比較，發(fā)現(xiàn)：
　　 1.無論有無假體的存在，相同解剖部位的感染中細菌群落的分布都具有很高的相似性；
　　 2.部分臨床診斷為“無菌性假體松動”的病例中可能也是有細菌感