直流電場對雞胚卵黃囊膜血管缺血模型的影響.pdf

1、目的：通過建立雞胚卵黃囊膜（Yolk sac membrane，Sac）血管缺血模型，探討外源性直流電場（Direct Current Electric Field，DCEF）對血管生長模式的影響，為進一步研究外源性直流電場對組織缺血損傷的組織再生修復的作用奠定基礎(chǔ)。
　　方法：將受精羅曼雞雞胚用75％酒精溶液消毒，置于孵化箱內(nèi)孵化，溫度37.5℃，濕度>70%；孵化72h后制作羅曼雞雞胚體外模型（outshell模型)，其中5枚

2、置于解剖顯微鏡下觀察并記錄雞胚Sac膜血流情況，根據(jù)血流情況利用 Photoshop軟件創(chuàng)建圖層繪制雞胚Sac膜血管模擬圖。再將雞胚outshell模型40枚隨機分為4組，每組10枚，A組為對照組，不做處理；B組為結(jié)扎組，僅結(jié)扎右側(cè)腹主血管；C組為不結(jié)扎右側(cè)腹主血管，但加載DCEF40mV/mm，其中胚體左側(cè)為正極，右側(cè)為負極；D組為結(jié)扎右側(cè)腹主血管血管后加載DCEF40mV/mm，其中胚體左側(cè)為正極，右側(cè)為負極。將A、B、C、D組均置

3、于恒溫恒濕箱內(nèi)繼續(xù)孵化，溫度37.5℃，濕度>70%，并利用CANON EOS Unitity軟件連接電腦對其進行實時動態(tài)拍攝，間隔30min拍攝一次，共拍攝24h，其中A組雞胚拍攝24h后繼續(xù)孵育直至雞胚死亡，并記錄雞胚體外存活時間；將拍攝的圖片整理后分別獲得0h,6h,12h,18h,24h的雞胚血管圖形，利用Photoshop軟件對圖片的灰度及明度值進行處理，Image J軟件分析血管的長度、角度及密度變化。其中B、D組還需記錄結(jié)

4、扎后右側(cè)再生主血管出現(xiàn)的時間及生長方向。
　　結(jié)果：
　　1.有效的建立了雞胚Sac膜體外模型，在溫度37.5℃，濕度>70%的孵育箱內(nèi)雞胚能存活并繼續(xù)發(fā)育，平均存活時間達82.65±14.07h（n=10）；
　　2.通過觀察雞胚Sac膜血管內(nèi)血液流經(jīng)情況（n=5），發(fā)現(xiàn)雞胚sac膜共有兩套基本對稱生長的血管：（1）腹主動脈及伴行靜脈與背主動脈及伴行靜脈。腹主動靜脈位于胚體右側(cè)，背主動靜脈位于胚體左側(cè)，且該套血管在正

5、常發(fā)育過程中均不會越過胚體的中軸線；（2）位于胚體上下方的血管均為靜脈血管分別為上極靜脈及下極靜脈；
　　3.有效的建立了雞胚Sac膜血管缺血模型，結(jié)扎右側(cè)腹主血管后，左側(cè)血管的生長速度及生長角度均會發(fā)生一定的改變，并能與右側(cè)再生血管形成新的交通支；
　　4.（1）左側(cè)終末支血管生長速度：左側(cè)終末支血管生長速度與結(jié)扎右側(cè)腹主血管、DCEF加載及DCEF加載方向均有關(guān)系:1）當Cosα0>0即DCEF加載后電場方向與血管生長方

6、向夾角<90°時，結(jié)扎右側(cè)腹主血管及電場加載均會促進血管生長，組間同一時段比較均有D>B>C>A（P<0.01），差異有統(tǒng)計學意義；但同一刺激因素下，血管生長速度的變化與孵育時間關(guān)系不大（24h內(nèi)），組內(nèi)不同時間段生長速度無明顯差異（P>0.05）。2）當cosα0<0即DCEF加載后電場方向與血管生長方向夾角>90°時，結(jié)扎右側(cè)腹主血管對血管生長起促進作用，DCEF隨著時間增加會抑制血管生長速度，組間同一時段比較（6h-0h），均有B

7、，D>A，C（P<0.01），差異有統(tǒng)計學意義；但B組與D組之間，A組與C組之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；隨著孵育時間增加到6h以后，DCEF對逆于電場方向生長的血管具有一定的抑制作用，12h-6h,18h-12h,24h-18h組均有:B,D>A>C(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義；同一組內(nèi)不同時間段中，C組中：6h-0h組>12h-6h組>18h-12h組,24h-18h組(P<0.05),即生長速度隨加電時間增加會受到抑

8、制，差異有統(tǒng)計學意義；D組中，24h-18h組生長速度慢于前三組時段(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。未加電組（A、B組）組內(nèi)不同時段生長速度無明顯差異。3）DCEF對血管生長的促進與否與DCEF加載方向有關(guān)，正向加電對血管生長速度促進作用明顯大于逆向加電；同一組同一時間段內(nèi)，C組與D組的Cosα0>0組血管生長速度大于Cosα0<0組(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。（2）血管偏轉(zhuǎn)角度的變化：左側(cè)終末支血管生長偏轉(zhuǎn)角度的變化與結(jié)扎

9、右側(cè)腹主血管及DCEF加載均有關(guān)系,且結(jié)扎右側(cè)腹主血管對左側(cè)終末支血管生長角度的變化要大于DCEF加載的影響。同一時間段內(nèi)均有：D>C>B>A（P<0.01），差異有統(tǒng)計學意義；同一組內(nèi),分別在B、C、D組中其余時間段血管偏轉(zhuǎn)角度的變化均比24h-18h組血管偏轉(zhuǎn)角度變化大（P<0.05），差異有統(tǒng)計學意義。（3）左側(cè)血管生長密度的變化主要與孵育時間及結(jié)扎右側(cè)腹主血管綜合因素有關(guān)，與DCEF加載與否關(guān)系不大。不同組相同時間點，在24h時

10、有B，D組（結(jié)扎組）>A，C組（未結(jié)組）(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義，B與D、A與C之間無明顯差異（P>0.05），其余時間點各組之間無明顯差異；同一組內(nèi)，僅B組及D組在18h、24h時與0h時相比密度有所增加(P<0.05)。（4）血管再生情況：B組再生主血管出現(xiàn)的時間遲于D組再生主血管出現(xiàn)的時間，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05)；再生主血管生長方向與水平方向的夾角：B組>D組，差異明顯（P<0.05），即D組再生主血管生長方向

11、與水平方向（電場方向）的夾角更小。
　　結(jié)論：
　　1.成功制備雞胚Sac膜體外培養(yǎng)模型及血管缺血模型，并且證實了對雞胚Sac膜血管進行定向調(diào)控具有可行性；
　　2.建立了雞胚Sac膜血管的生長速度、角度及密度的研究方法；
　　3.（1）左側(cè)終末支血管生長速度與DCEF加載、DCEF加載后的電場方向、血管結(jié)扎導致的組織局部缺血缺氧有關(guān)，當血管生長方向與電場方向一致時，DCEF對血管生長起促進作用；當血管生長方向與

12、電場方向相反時，DCEF對血管生長起抑制作用；其中局部缺血缺氧對血管生長速度的影響要大于DCEF對血管生長速度的影響，當血管生長方向與電場方向一致時二者具有協(xié)同作用。（2）左側(cè)終末支血管生長的角度偏轉(zhuǎn)與DCEF加載及組織局部缺血缺氧有關(guān)，血管會向著電場方向、缺血缺氧部位偏轉(zhuǎn)，組織局部缺血缺氧對左側(cè)終末支血管偏轉(zhuǎn)角度的影響大于DCEF對血管偏轉(zhuǎn)角度的影響。隨著時間增加，當血管偏轉(zhuǎn)角度達到一定程度后，角度的變化會隨著時間的增加而減小。（3）