脈沖直流電場誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的作用研究.pdf

1、研究背景:
　　自19世紀(jì)發(fā)現(xiàn)人體生理電場以來，從細(xì)胞實驗到在體實驗，人們對電場誘導(dǎo)細(xì)胞遷移、促進創(chuàng)面愈合的作用進行了大量研究。研究發(fā)現(xiàn)，正常皮膚表皮或上皮組織細(xì)胞間能夠維持定向的離子流動，從而形成縱向電位差;當(dāng)皮膚或上皮組織的完整性受到破壞、形成創(chuàng)面時，該電位差在創(chuàng)面處迅速短路，使電流從正常組織區(qū)域流向創(chuàng)面，形成電場方向指向創(chuàng)面的橫向電場，這即是創(chuàng)面內(nèi)源性電場。近年研究顯示，創(chuàng)面內(nèi)源性電場是指導(dǎo)表皮細(xì)胞定向遷移的關(guān)鍵因素，而后者

2、是創(chuàng)面愈合的前題基礎(chǔ)。體外實驗發(fā)現(xiàn)，表皮細(xì)胞能在外加持續(xù)直流電場下產(chǎn)生定向遷移，該現(xiàn)象稱為表皮細(xì)胞的電趨性。目前，國內(nèi)外多數(shù)研究均采用持續(xù)直流電場作為刺激因素研究細(xì)胞的電趨性及其機制。然而，持續(xù)直流電場長時間作用將不可避免導(dǎo)致熱效應(yīng)和電解效應(yīng)等電刺激副作用，使得持續(xù)直流電場的在體應(yīng)用受到限制、現(xiàn)有研究與臨床應(yīng)用脫軌。我們前期發(fā)現(xiàn)，處于持續(xù)直流電場環(huán)境中的成纖維細(xì)胞去掉電場作用后，其電趨性并不會立即消失，而在一定時間內(nèi)仍表現(xiàn)出較強的定向遷

3、移特性，提示細(xì)胞的電趨性誘導(dǎo)或維持并不需要持續(xù)的電刺激，進而我們推測脈沖直流電可能同樣具有誘導(dǎo)細(xì)胞電趨性的作用。
　　脈沖直流電場(PDCEF)是一種間斷作用的直流電場，具有場強(EF)、頻率(f)和脈寬(D)三個可變參數(shù)。與持續(xù)直流電場(CDCEF)相比，PDCEF能通過調(diào)節(jié)脈寬進而調(diào)節(jié)電場的作用時間;若低脈寬的脈沖直流電能誘導(dǎo)細(xì)胞電趨性，那么無疑將顯著減少電場對細(xì)胞的作用時間，減輕電場的熱效應(yīng)和電解效應(yīng)，從而有可能為臨床應(yīng)用電

4、場促進創(chuàng)面愈合提供新的技術(shù)方法。本研究旨在探討不同參數(shù)條件下PDCEF對表皮細(xì)胞電趨性的誘導(dǎo)作用;通過與相同場強的CDCEF比較，評估PDCEF誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的效能與副作用，為臨床應(yīng)用PDCEF促進創(chuàng)面愈合奠定實驗基礎(chǔ)。
　　材料與方法:
　　1、乳鼠原代表皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與細(xì)胞電趨性實驗?zāi)Ｐ偷慕?br>　　取出生1-3天的Balb/c乳鼠全層皮膚，用DispaseⅡ溶液4℃孵育過夜;次日分離表皮，將其剪碎后用0.2

5、5％胰酶消化約5min，血清終止消化，反復(fù)吹打后過濾、離心;調(diào)整細(xì)胞密度至1×103后將細(xì)胞接種于細(xì)胞爬片，置于37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)待用。
　　將構(gòu)建的電趨性小室模型浸泡于75％的酒精中30min，然后置于超凈臺紫外燈下照射30min。將接種有表皮細(xì)胞的細(xì)胞爬片置入電趨性小室，在電趨性小室兩側(cè)加細(xì)胞培養(yǎng)基各2ml，使電趨性小室中充滿培養(yǎng)基;常規(guī)構(gòu)筑外加電場裝置，將構(gòu)建好的細(xì)胞電趨性實驗?zāi)Ｐ椭糜诨罴?xì)胞工作站，實時動態(tài)觀察細(xì)胞

6、在電場作用下的遷移運動。
　　2、脈沖直流電場誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的作用和特性分析
　　1)選取一定參數(shù)的PDCEF(EF=150mV/mm，D=60％，f=0.1Hz)作用表皮細(xì)胞3h，Image J軟件分析表皮細(xì)胞運動的方向性和速度，明確PDCEF是否具有表皮細(xì)胞電趨性誘導(dǎo)作用。
　　2)固定PDCEF頻率為0.1Hz、脈寬為60％，觀察場強變化(0-200mV/mm)對表皮細(xì)胞電趨性的影響。
　　3)固定PD

7、CEF頻率為0.1Hz、場強為150 mV/mm，觀察脈寬變化(0-100％)對表皮細(xì)胞電趨性的影響。由于脈寬為100％的PDCEF實質(zhì)上為CDCEF，因此上述實驗可用于對比分析相同場強作用條件下PDCEF和CDCEF誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的差異。
　　4)固定PDCEF場強為150 mV/mm、脈寬為60％，觀察頻率(0.001-5000000Hz)變化對細(xì)胞電趨性的影響。
　　3、脈沖和持續(xù)直流電場誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性和介導(dǎo)電

8、化學(xué)副反應(yīng)的對比研究
　　1)在場強(50-250 mV/mm)相同的條件下，對比分析不同脈寬(20-80％)的PDCEF（頻率為0.1Hz）和CDCEF（脈寬為100％的PDCEF）誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的差異。
　　2)分析在場強(50-250 mV/mm)相同的條件下，當(dāng)不同脈寬(40-80％)的PDCEF（頻率為0.1Hz）實際作用于細(xì)胞的電刺激時間與CDCEF相同時表皮細(xì)胞電趨性差異。
　　3)在相同場強(EF=

9、150mV/mm)作用條件下，對比分析PDCEF和CDCEF對電趨性模型中溶液或細(xì)胞培養(yǎng)基pH值和mV值變化的影響，明確PDCEF和CDCEF介導(dǎo)電化學(xué)副反應(yīng)差異。
　　結(jié)果:
　　1、乳鼠原代表皮細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞電趨性實驗?zāi)Ｐ徒?br>　　原代小鼠表皮細(xì)胞接種培養(yǎng)4h左右開始貼壁、伸展，細(xì)胞輪廓清晰，呈圓形或橢圓形，可見偽足伸展，折光性好，生長旺盛。構(gòu)建的電趨性實驗裝置可用于活細(xì)胞工作站下實時動態(tài)觀察細(xì)胞的遷移運動;電場持

10、續(xù)作用3h，電趨性小室兩側(cè)電壓波動小，表明實驗裝置具有良好的穩(wěn)定性。
　　2、脈沖直流電場誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的特性分析
　　1)在3h的觀察時間內(nèi)，無電場作用的表皮細(xì)胞呈現(xiàn)隨機運動(方向性:-0.09±0.05);而PDCEF(EF=150mV/mm，D=60％，f=0.1Hz)作用的表皮細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的向電場陰極遷移運動（方向性:0.76±0.04），同時在X軸方向上的運動速度顯著增高。時效分析顯示，施加PDCEF30分鐘內(nèi)

11、，表皮細(xì)胞即表現(xiàn)出向電場陰極定向遷移的特性，且運動速度增加。
　　2)在固定頻率(0.1Hz)和脈寬(60％)的條件下，PDCEF誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的特性與場強呈正相關(guān);場強越高，表皮細(xì)胞的電趨性越好，表現(xiàn)為細(xì)胞運動的方向性和速度增加。場強為50 mV/mm時，表皮細(xì)胞向電場陰極遷移的方向性為0.35±0.05，提示該條件下PDCEF誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的閾值電壓在50 mV/mm以下。
　　3)在固定頻率(0.1Hz)和場強

12、(150 mV/mm)的條件下，PDCEF誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的特性與脈寬呈正相關(guān);脈寬越大，表皮細(xì)胞的電趨性越好。脈寬為20％時，表皮細(xì)胞向電場陰極遷移的方向性為0.26±0.05，提示該條件下PDCEF誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的閾值脈寬為20％左右。當(dāng)脈寬達到或大于60％時，表皮細(xì)胞向陰極遷移的方向性增加不再顯著，與100％的脈寬（實質(zhì)為持續(xù)直流電場）比較無顯著差異。
　　4)在固定場強(150 mV/mm)和脈寬(60％)的條件下，

13、0.001-1000Hz之內(nèi)的頻率變化對PDCEF誘導(dǎo)的表皮細(xì)胞電趨性無顯著影響;當(dāng)頻率達到5000000Hz時，表皮細(xì)胞的電趨性顯著下降。
　　3、脈沖和持續(xù)直流電場誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性和電化學(xué)副反應(yīng)的對比研究
　　1)在場強相同的條件下，達到一定閾值脈寬的PDCEF（頻率為0.1Hz）均能誘導(dǎo)與CDCEF等效的電趨性。場強為50 mV/mm時，PDCEF達到與CDCEF等效電趨性的閾值脈寬為80％;場強為150 mV/mm

14、時，PDCEF達到與CDCEF等效電趨性的閾值脈寬為60％;場強為250 mV/mm時，PDCEF達到與CDCEF等效電趨性的閾值脈寬為40％。
　　2)在場強相同的條件下，當(dāng)PDCEF（頻率為0.1Hz）實際作用于細(xì)胞的電刺激時間與CDCEF相同時，PDCEF較之CDCEF能以更短的實際電刺激時間誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性。場強為50、150和250mV/mm時，PDCEF誘導(dǎo)表皮細(xì)胞出現(xiàn)電趨性的時間分別為30min、15min和15m

15、in;而CDCEF誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性出現(xiàn)的時間分別為45min，45min和30min，提示間斷電刺激能增強表皮細(xì)胞的電趨性反應(yīng)。
　　3)在場強相同的條件下，PDCEF所導(dǎo)致的細(xì)胞培養(yǎng)基或緩沖液pH和mV值改變顯著小于CDCEF，且隨時間的增加，這一趨勢越明顯。
　　結(jié)論:
　　1、PDCEF具有誘導(dǎo)表皮細(xì)胞電趨性的重要作用，其電趨性誘導(dǎo)效應(yīng)呈場強、作用時間、脈寬和頻率依賴性。
　　2、在場強相同的條件下，達到