直流電場誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞膠原凝膠方向性收縮的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　瘢痕增生攣縮畸形是深度燒傷創(chuàng)面愈合后普遍存在的問題，其不僅影響美觀，而且往往導(dǎo)致肢體關(guān)節(jié)和功能部位的活動(dòng)障礙，甚至功能的永久性喪失，是制約目前燒傷患者愈后生存質(zhì)量提高的關(guān)鍵，也是燒傷學(xué)科一直未能攻克的重大科學(xué)難題。
　　既往研究表明，瘢痕持續(xù)收縮以致瘢痕攣縮畸形形成的原因，一方面歸咎于瘢痕組織中成纖維細(xì)胞的不斷增殖和膠原纖維的大量沉積;另一方面與瘢痕組織中成纖維細(xì)胞和膠原纖維的組織排列結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系。電子顯微鏡掃

2、描觀察發(fā)現(xiàn):瘢痕組織中成纖維細(xì)胞與其胞外的膠原纖維呈平行于瘢痕攣縮方向排布;推測細(xì)胞通過骨架分子與胞外膠原纖維錨定，持續(xù)產(chǎn)生并維持方向性收縮張力，是瘢痕攣縮的關(guān)鍵病理結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。既往研究對(duì)揭示瘢痕攣縮的細(xì)胞與分子機(jī)制具有重要的啟示意義;然而，由于缺乏能有效模擬臨床患者瘢痕攣縮動(dòng)態(tài)變化過程的體外研究模型，長期以來人們對(duì)瘢痕攣縮的認(rèn)識(shí)也僅限于組織切片觀察和理論分析，對(duì)瘢痕攣縮的細(xì)胞與分子機(jī)制缺乏系統(tǒng)和深入闡明。
　　1979年，Bell

3、等人通過鼠尾膠原蛋白與成纖維細(xì)胞混合培養(yǎng)，首次建立了成纖維細(xì)胞膠原凝膠(FPCL)模擬瘢痕收縮的體外模型，揭示了成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞是瘢痕收縮的主要效應(yīng)細(xì)胞，同時(shí)發(fā)現(xiàn)FPCL的收縮速度和幅度與成纖維細(xì)胞接種密度、膠原蛋白濃度和類型等有密切關(guān)系。采用該模型并結(jié)合在體研究，Ehrlich等人提出，成纖維細(xì)胞快速肌球蛋白ATP酶活化，促進(jìn)細(xì)胞微絲骨架重組，引起胞質(zhì)微絲與胞外膠原纖維結(jié)合，改變膠原排布結(jié)構(gòu)，是創(chuàng)面收縮啟動(dòng)的重要機(jī)制;在收縮張

4、力作用下，肌成纖維細(xì)胞持續(xù)肌球蛋白ATP酶活化，通過微絲應(yīng)力纖維持續(xù)緊張維持?jǐn)伩s張力，表明細(xì)胞骨架-微絲應(yīng)力纖維在啟動(dòng)和維持瘢痕收縮中具有重要作用，深化了人們對(duì)瘢痕攣縮機(jī)制的認(rèn)識(shí)。然而，近30年以來，F(xiàn)PCL模型并沒有幫助人們?cè)诳刂岂：蹟伩s畸形方面取得突破，其根本原因在于該模型并不能模擬臨床患者瘢痕組織方向性收縮這個(gè)最重要的特征。在Bell等人制作的FPCL模型中，成纖維細(xì)胞呈隨機(jī)排列分布，凝膠呈向心性收縮，這與在體關(guān)節(jié)等功能部位瘢痕的

5、方向性攣縮及其病理結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也即成纖維細(xì)胞耦合膠原纖維呈平行于瘢痕攣縮方向的定向排列方式存在本質(zhì)差別，因而不是模擬臨床瘢痕方向性攣縮的理想模型。
　　生物電場是生物界的普遍現(xiàn)象，從低等的微生物到高等的哺乳動(dòng)物，均廣泛存在。研究顯示，生物電場在損傷愈合、組織再生、胚胎及個(gè)體發(fā)育等過程中發(fā)揮了重要作用。創(chuàng)面內(nèi)源性直流電場是創(chuàng)面形成后自發(fā)產(chǎn)生的生物電場，當(dāng)皮膚出現(xiàn)損傷時(shí)，皮膚破損處跨表皮電勢差消失，而傷口周圍皮膚電勢差維持正常，繼而在創(chuàng)

6、面與周圍正常皮膚之間形成以創(chuàng)緣為正極、創(chuàng)面中心為負(fù)極，大小為50～200 mV/mm的內(nèi)源性直流電場。該電場伴隨創(chuàng)面一直存在，直至創(chuàng)面最終愈合才消失。創(chuàng)面內(nèi)源性直流電場對(duì)調(diào)節(jié)創(chuàng)面修復(fù)相關(guān)細(xì)胞的形態(tài)、運(yùn)動(dòng)、增殖、遷移和排列變化都具有重要作用，是影響創(chuàng)面愈合的重要生物學(xué)信號(hào)。體外研究發(fā)現(xiàn)，外源性生理強(qiáng)度直流電場可誘導(dǎo)人、小鼠、大鼠等多種真皮成纖維細(xì)胞趨向呈垂直電場矢量方向定向排列。然而不同種類的成纖維細(xì)胞對(duì)外源性直流電場的生物反應(yīng)性存在差異

7、。電場作用24h，人真皮成纖維細(xì)胞趨向呈垂直電場矢量方向定向排列的電壓閾值為100mV/mm;電場作用3h，3T3小鼠成纖維細(xì)胞趨向呈垂直電場矢量方向定向排列的電壓閾值為200mV/mm。上述提示，生理強(qiáng)度外源性直流電場誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞垂直于電場矢量方向定向排列的作用呈電場作用時(shí)間和電場強(qiáng)度依賴性。
　　本研究基于成纖維細(xì)胞在直流電場環(huán)境中定向排列的特性，探索采用直流電場技術(shù)誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞膠原凝膠方向性收縮，以發(fā)展更接近于臨床關(guān)節(jié)等

8、功能部位瘢痕方向性攣縮的體外研究模型，為深入研究瘢痕攣縮的細(xì)胞分子機(jī)制、發(fā)展有效防治瘢痕攣縮畸形的臨床新策略，奠定良好的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.外源性直流電場誘導(dǎo)2D培養(yǎng)條件下成纖維細(xì)胞定向排列的作用研究
　　構(gòu)建針對(duì)2D培養(yǎng)細(xì)胞的外源性直流電場施加裝置，觀察不同強(qiáng)度的直流電場對(duì)2D培養(yǎng)成纖維細(xì)胞定向排列的影響及其與電場強(qiáng)度和電場作用時(shí)間的效應(yīng)關(guān)系。
　　2.外源性直流電場誘導(dǎo)3D培養(yǎng)條件下成纖維細(xì)

9、胞定向排列的作用研究
　　構(gòu)建針對(duì)3D培養(yǎng)細(xì)胞的外源性直流電場施加裝置，觀察不同強(qiáng)度的直流電場對(duì)3D培養(yǎng)條件下成纖維細(xì)胞定向排列的影響及其與電場強(qiáng)度和電場作用時(shí)間的效應(yīng)關(guān)系。
　　3.外源性直流電場誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞膠原凝膠方向性收縮的實(shí)驗(yàn)研究
　　構(gòu)建成纖維細(xì)胞膠原凝膠(FPCL)模型，明確誘導(dǎo)FPCL收縮的適宜細(xì)胞密度;在此基礎(chǔ)上，對(duì)FPCL施加外源性直流電場，觀察FPCL中成纖維細(xì)胞定向排列和FPCL方向性收縮變化，

10、明確直流電場對(duì)成纖維細(xì)胞膠原凝膠方向性收縮的誘導(dǎo)作用。
　　4.外源性直流電場誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞膠原凝膠方向性收縮的骨架機(jī)制
　　采用骨架解聚劑或促進(jìn)骨架聚合的方法，明確微絲或微管骨架在外源性直流電場誘導(dǎo)FPCL方向性收縮和成纖維細(xì)胞定向排列中的作用。
　　結(jié)果:
　　1.在2D培養(yǎng)環(huán)境下，未施加外源性直流電場的成纖維細(xì)胞呈隨機(jī)排列分布，其極向值為-0.02±0.10;100 mV/mm的外源性直流電場作用成纖維細(xì)胞

11、4h，成纖維細(xì)胞趨于垂直電場矢量方向排列，其極向值增加至0.56±0.07。直流電場誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞定向排列的作用呈時(shí)間和電場強(qiáng)度依賴性。
　　2.外源性直流電場可誘導(dǎo)膠原凝膠(3D)培養(yǎng)條件下成纖維細(xì)胞趨于垂直電場矢量方向定向排列，該作用呈電場強(qiáng)度和作用時(shí)間依賴性，其中以300 mV/mm的直流電場作用4h對(duì)成纖維細(xì)胞定向排列的誘導(dǎo)作用最為明顯，細(xì)胞極向值可達(dá)0.69±0.06。
　　3.成功構(gòu)建成纖維細(xì)胞膠原凝膠(FPCL

12、)收縮模型。FPCL呈正圓形收縮，其收縮強(qiáng)度呈成纖維細(xì)胞密度依賴性。
　　4.外源性直流電場(300 mV/mm，4h)可使FPCL模型中成纖維細(xì)胞趨于垂直電場矢量方向定向排列，從而誘導(dǎo)FPCL呈橢圓形收縮，即:其垂直電場矢量方向的收縮顯著強(qiáng)于平行電場矢量方向收縮。
　　5.直流電場對(duì)成纖維細(xì)胞微絲和微管的形態(tài)結(jié)構(gòu)和表達(dá)分布無明顯影響。采用微絲解聚劑-細(xì)胞松弛素D可顯著抑制直流電場誘導(dǎo)的FPCL方向性收縮;而微管解聚劑-秋水

13、仙素對(duì)直流電場誘導(dǎo)的FPCL方向性收縮無明顯影響。
　　6.微絲或微管解聚對(duì)直流電場誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞定向排列無顯著影響;采用高表達(dá)磷酸化或非磷酸化HSP27增強(qiáng)或抑制成纖維細(xì)胞內(nèi)源性微絲應(yīng)力纖維亦不影響直流電場對(duì)成纖維細(xì)胞定向排列的誘導(dǎo)作用。
　　結(jié)論:
　　1.外源性直流電場可誘導(dǎo)2D和3D培養(yǎng)條件下成纖維細(xì)胞定向排列，使成纖維細(xì)胞膠原凝膠(FPCL)呈方向性收縮。
　　2.成纖維細(xì)胞定向排列是外源性直流電場誘