成纖維細(xì)胞膠原吞噬亞群功能分子標(biāo)志物（uPARAP）的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景與目的： 成纖維細(xì)胞是多種具有明顯異質(zhì)性和獨(dú)特表型的成纖維細(xì)胞亞群的總稱，不同的亞群具有不盡相同的生物學(xué)功能。成纖維細(xì)胞是維持膠原代謝平衡的主要細(xì)胞，在器官纖維化、創(chuàng)傷愈合中發(fā)揮關(guān)鍵作用。 膠原降解代謝有兩條途徑，即胞內(nèi)途徑和胞外途徑。成纖維細(xì)胞吞噬降解膠原是主要的胞內(nèi)途徑，也是組織器官更新和創(chuàng)傷修復(fù)的重要機(jī)制。一些纖維化性疾病，甚至腫瘤轉(zhuǎn)移均與膠原胞內(nèi)降解代謝紊亂有關(guān)。 在體外培養(yǎng)的牙齦成纖維細(xì)胞中，具

2、有吞噬膠原能力的細(xì)胞亞群所占比例最多可達(dá)80％。但至今未見有關(guān)成纖維細(xì)胞膠原吞噬(CPSF)和非吞噬亞群(nCPSF)分子特征的研究報道，其難點(diǎn)在于尚無法將CPSF和nCPSF分離，既往有關(guān)成纖維細(xì)胞的大量研究均是以混合成纖維細(xì)胞群為研究對象，影響了結(jié)果的精確性。 本研究嘗試通過CPSF和nCPSF膠原吞噬功能的差異建立分離方法。通過生物芯片技術(shù)和real-time PCR篩選、驗(yàn)證兩者差異表達(dá)基因，并采用免疫熒光技術(shù)檢測其蛋白

3、在CPSF和nCPSF中的表達(dá)，尋找CPSF和nCPSF具有特征性的分子標(biāo)志物。研究分子標(biāo)志物在成纖維細(xì)胞吞噬膠原過程中的作用，并以標(biāo)志物為靶分子，探討建立新的細(xì)胞分離方法的可行性，為進(jìn)一步研究成纖維細(xì)胞亞群奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.取健康志愿者的正常牙齦，采用組織塊培養(yǎng)法獲得體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞。將可溶性Ⅰ型鼠尾膠原蛋白或鼠IgG包被FITC-LB，按細(xì)胞：微球=1∶4比例將已制備好的COL-FITC-LB或IgG-FI

4、TC-LB溶液分別加入各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)，檢測成纖維細(xì)胞0.5、1、2、4、6、12、24h對IgG-FITC-LB和COL-FITC-LB的吞噬率。 2.體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞加入COL-FITC-LB6h后，上流式細(xì)胞儀分選CPSF和nCPSF。體外培養(yǎng)分選后的CPSF和nCPSF，倒置顯微鏡下觀察其生長情況，每次傳代前檢測牙齦成纖維細(xì)胞4h膠原吞噬率。 3.將來自3位健康志愿者體外培養(yǎng)的牙齦成纖維細(xì)胞等量混合，轉(zhuǎn)至待測管

5、內(nèi)。流式細(xì)胞儀分選CPSF和nCPSF。分別提取CPSF和nCPSF總RNA，通過人類基因組U133A 2.0芯片技術(shù)篩選獲得CPSF和nCPSF差異基因表達(dá)譜。 4.依據(jù)與細(xì)胞吞噬膠原過程的相關(guān)性，從差異基因表達(dá)譜中挑選出膠原吞噬功能相關(guān)基因，并采用Real-time PCR進(jìn)一步驗(yàn)證。 5.通過半定量RT-PCR和免疫熒光定位技術(shù)，分別檢測4健康志愿者的CPSF和nCPSF中整合素α2、uPARAP的mRNA和蛋白表

6、達(dá)，比較研究整合素α2和uPARAP在成纖維細(xì)胞膠原吞噬過程中的作用，探討以uPARAP為靶分子分離CPSF的可行性。 結(jié)果： 1.成纖維細(xì)胞在0.5h內(nèi)即開始吞噬膠原及IgG-FITC-LB，IgG-FITC-LB吞噬率在1h達(dá)到峰值后保持穩(wěn)定；而COL-FITC-LB吞噬率在4h接近峰值，隨后保持穩(wěn)定；6h之后成纖維細(xì)胞對COL-FITC-LB的吞噬率比IgG-FITC-LB吞噬率高10倍以上。 2.體外培養(yǎng)

7、分選后的CPSF 24h，未見貼壁，逐漸死亡。nCPSF培養(yǎng)6h后，大部分細(xì)胞貼壁，并正常生長增殖、傳代。第1次傳代前4hCOL-FITC-LB吞噬率僅12.17％，第2次傳代前COL-FITC-LB吞噬率升至34.76％，第3次傳代前COL-FITC-LB吞噬率達(dá)60.65％，接近未經(jīng)分選的混合細(xì)胞群的COL-FITC-LB吞噬率。 3.從18400個轉(zhuǎn)錄本(代表14500個明晰的基因)中篩選出CPSF和nCPSF差異表達(dá)基因

8、共17個，其中上調(diào)表達(dá)基因12個，下調(diào)表達(dá)基因有5個。 4.從12個上調(diào)表達(dá)基因中，挑選出與膠原吞噬功能可能相關(guān)的3個候選基因，即uPARAP、CYBB和HOOK1，通過Real-timePCR擴(kuò)增后比較其差異表達(dá)相對量。結(jié)果顯示，CPSF中uPARAP表達(dá)量為nCPSF的2788倍CPSF中CYBB表達(dá)量為nCPSF的0.85倍；CPSF中HOOK1表達(dá)量為nCPSF的1.96倍。 5.體外培養(yǎng)的4例正常牙齦成纖維細(xì)胞

9、均有同樣的表現(xiàn)：CPSF中uPARAP mRNA表達(dá)顯著，而在nCPSF中uPARAP mRNA無表達(dá)。在CPSF和nCPSF中整合素α2 mRNA均有顯著的表達(dá)。 6.體外培養(yǎng)的4例正常牙齦成纖細(xì)胞中，幾乎所有細(xì)胞均表達(dá)整合素α2蛋白，而uPARAP蛋白只在部分細(xì)胞中表達(dá)，小部分細(xì)胞不表達(dá)。uPARAP蛋白在CPSF中表達(dá)，在nCPSF中基本不表達(dá)，但整合素α2蛋白在CPSF和nCPSF中均有明顯的表達(dá)。 結(jié)論：

10、 1.利用CPSF和nCPSF在膠原吞噬功能上的差異，聯(lián)合應(yīng)用COL-FITC-LB吞噬技術(shù)和FCM細(xì)胞分離技術(shù)能夠?qū)烧叱晒Ψ蛛x，建立了分離CPSF和nCPSF的新方法，也為探討CPSF和nCPSF的生理和病理學(xué)意義提供了新的技術(shù)平臺。 2.CPSF和nCPSF最主要的差異表達(dá)基因是uPARAP。CPSF細(xì)胞表面表達(dá)uPARAP蛋白分子，而nCPSF不表達(dá)，uPARAP是CPSF的功能分子標(biāo)志物，可用于鑒別或分離CPSF，為