染色體1p13上位點(diǎn)多態(tài)性與糖尿病下肢血管病變的相關(guān)性研究及其機(jī)制的探討.pdf

1、糖尿病下肢血管病變（lower-extremity arterial disease，LEAD）又稱糖尿病周圍動(dòng)脈疾?。╬eripheral arterial disease，PAD），目前研究認(rèn)為糖尿病下肢血管病變的病理機(jī)制與動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的形成有關(guān)。
　　AS是下肢血管病變與冠狀動(dòng)脈疾?。–oronary Artery Disease，CAD）共同的病理基礎(chǔ)。與CAD相似，血脂異常、吸煙、

2、高血壓及糖尿病亦是PAD的危險(xiǎn)因素。此外，遺傳因素在PAD的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。全基因組關(guān)聯(lián)研究（Genome-wide Association Study，GWAS）發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的位點(diǎn)，其中有些位點(diǎn)對(duì)疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有升高作用，有些位點(diǎn)對(duì)疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)則具有降低作用，其發(fā)現(xiàn)的遺傳變異研究已經(jīng)被用來預(yù)測(cè)CAD及PAD。而染色體9p21上的位點(diǎn)rs1333049不僅與CAD相關(guān)，同時(shí)與PAD相關(guān)，表明冠狀動(dòng)脈疾病及外周動(dòng)脈

3、疾病可能存在共同的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。
　　國內(nèi)外多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，rs599839單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與CAD的發(fā)生存在顯著關(guān)聯(lián)，rs599839及rs646776與急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)亦顯著相關(guān)。同時(shí)，GWAS還發(fā)現(xiàn)，人類染色體1p13上的位點(diǎn)rs599839、rs646776及rs12740374與血清膽固

4、醇（Total Cholesterol，TC）和/或低密度脂蛋白膽固醇（Low Density Lipoprotein Cholesterol，LDL-C）顯著相關(guān)。rs599839 SNP是心肌梗死和 LDL-C的風(fēng)險(xiǎn)變異，其機(jī)制可能與 rs12740374 SNP相關(guān)。sortilin1是定位于高爾基體的細(xì)胞內(nèi)蛋白，介導(dǎo)了包含載脂蛋白B的脂質(zhì)顆粒的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。rs12740374 T位點(diǎn)使SORT1 mRNA的表達(dá)增加， sortil

5、in1蛋白水平升高，從而降低了血液中VLDL和LDL水平，進(jìn)而降低冠脈疾病患病風(fēng)險(xiǎn)。而rs12740374 G位點(diǎn)作用與之相反。
　　血糖及糖化血紅蛋白水平是反映機(jī)體糖代謝狀況的重要指標(biāo)。當(dāng)血糖調(diào)節(jié)異常時(shí)，可以增加2型糖尿病及大血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。GWAS已經(jīng)確定了與血糖相關(guān)的32個(gè)位點(diǎn)，其中有些位點(diǎn)與2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)亦相關(guān)。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，印度錫克教徒染色體1p13上位點(diǎn)rs599839與空腹血糖水平及2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，

6、但在中國尚未見報(bào)道。
　　綜上所述，1p13上的位點(diǎn)與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及血糖、血脂異常存在一定的相關(guān)性，同時(shí)這些位點(diǎn)還與CAD及MI患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。本文將研究1p13上rs599839、rs646776及rs12740374位點(diǎn)SNP與糖尿病下肢動(dòng)脈粥樣硬化性血管病變相關(guān)性，并探討其可能機(jī)制，以期更好的理解疾病的病理生理學(xué)機(jī)制及發(fā)現(xiàn)疾病治療的新靶點(diǎn)。
　　第一部分染色體1p13上位點(diǎn)rs599839、rs6467

7、76及rs12740374多態(tài)性與糖尿病下肢血管病變的相關(guān)性研究
　　目的：探討染色體1p13上位點(diǎn)rs599839、rs646776、rs12740374與2型糖尿病患者下肢血管病變的相關(guān)性。
　　方法：
　　1本研究DM組選取442例2型糖尿病患者，DMPAD組選取440例糖尿病PAD患者，所有研究對(duì)象均來自中國漢族人群，無血緣關(guān)系。排除甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)及減退，嚴(yán)重肝腎功能障礙及基因分型失敗者。
　　2收集所有

8、受試者的身高、體重、血壓、踝肱指數(shù)（ABI）、糖化血紅蛋白（HbA1C）、血脂等。提取外周血白細(xì)胞基因組DNA，應(yīng)用Taqman探針技術(shù)對(duì)3個(gè)候選SNPs進(jìn)行基因分型。
　　3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用 SPSS16.0軟件,兩組人群基因型頻率采用Hardy-Weinberg平衡定律檢驗(yàn)。計(jì)量資料組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)及秩和檢驗(yàn)。用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算各組基因型和等位基因頻率（構(gòu)成比），計(jì)數(shù)資料、各組基因型和等位基因頻率之間比較采用卡方檢驗(yàn)。單

9、因素及多因素分析采用Logistic回歸分析。
　　結(jié)果：1 DMPAD組與 DM組相比，年齡、病程、吸煙、高血壓、HbA1C、TC、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、LDL-C、體重指數(shù)（BMI）、降脂治療、冠心病及腦梗死患病率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），性別、甘油三酯（TG）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；2 DMPAD組與 DM組相比，rs599839 A與G、rs646776 A與G、rs12740374 G與T

10、等位基因頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在顯性模型，rs599839 AA與AG+GG， rs646776 AA與AG+GG，rs12740374 CC與CT+TT基因型頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在隱性模型，rs599839 AA+AG與GG，rs646776 AA+AG與GG，rs12740374 CC+CT與TT基因型頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；3在DMPAD及DM組，rs599839 Hardy-

11、Weinberg平衡檢驗(yàn)?2值分別為0.069和0.439，P值分別為0.792和0.507；rs646776 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)?2值分別為0.881和1.393，P值分別為0.347和0.237；rs12740374 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)?2值分別為0.376和0.340， P值分別為0.539和0.559。3個(gè)位點(diǎn)基因型頻率均符合 Hardy-Weinberg遺傳平衡（P＞0.05）；4單因素lo

12、gistic回歸分析表明，年齡、病程、吸煙、高血壓、降脂治療、HbA1C、TC、HDL-C、LDL-C、BMI、rs599839、rs646776、rs12740374基因型、冠心病及腦梗死均與糖尿病PAD相關(guān)（P＜0.05）。多因素logistic回歸分析，年齡、HbA1C、TG、LDL-C、吸煙、高血壓、糖尿病病程、冠心病及腦梗死是糖尿病PAD的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素（P＜0.05），而 HDL-C、rs599839、rs646776、rs1

13、2740374基因型是糖尿病PAD的保護(hù)因素（P＜0.05）。
　　第二部分1p13上位點(diǎn)rs599839、rs646776及rs12740374多態(tài)性與糖脂代謝的關(guān)聯(lián)研究
　　目的：探討染色體1p13上位點(diǎn)rs599839、rs646776及rs12740374與血糖、血脂的相關(guān)性。
　　方法：
　　1研究人群同第一部分。收集所有受試者的身高、體重、血壓、ABI、空腹血糖（ Fasting Plasma Glu

14、cose， FPG）、餐后血糖（ Post-Prandial Glucosese，PPG）、HbA1C、TC、TG、HDL-C及LDL-C。
　　2提取外周血單個(gè)核細(xì)胞基因組DNA，應(yīng)用Taqman探針技術(shù)對(duì)3個(gè)候選SNPs進(jìn)行基因分型。
　　3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS16.0軟件，正態(tài)分布計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非正態(tài)分布資料經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換成正態(tài)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)表示，基因型與各指標(biāo)相關(guān)性采用協(xié)方差分析

15、和spearman法進(jìn)行檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：1校正年齡、性別、吸煙、高血壓、降脂治療后，所有研究人群rs599839、rs646776及rs12740374不同基因型間LDL-C差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；spearman相關(guān)分析表明兩者呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)分別為-0.166、-0.131及-0.146；2所有研究人群校正年齡、性別、吸煙、高血壓、降脂治療后，rs599839、rs646776及rs12740374不同基因型間

16、FPG、PPG、HbA1c、TC、TG、HDL-C、BMI差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；3校正年齡、性別、吸煙、高血壓、降脂治療后，DMPAD組rs599839AA與AG+GG、rs646776AA與AG+GG、rs12740374GG與GT+TT基因型相比，LDL-C差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；spearman相關(guān)分析表明兩者呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)分別為-0.172、-0.129及-0.150。
　　4、DMPAD組校

17、正年齡、性別、吸煙、高血壓、降脂治療后，rs599839、rs646776及rs12740374不同基因型間 FPG、PPG、HbA1c、TC、TG、HDL-C、BMI差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　第三部分1p13上位點(diǎn)rs599839、rs646776及rs12740374多態(tài)性與糖尿病下肢血管病變相關(guān)性的機(jī)制研究
　　目的：探討染色體1p13上位點(diǎn)rs599839、rs646776、rs12740374位點(diǎn)基

18、因多態(tài)性在糖尿病下肢血管病變發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1分別對(duì)第一部分DM組及DMPAD組進(jìn)行rs599839、rs646776及rs12740374基因型連鎖不平衡及單倍體型分析。
　　2考慮到rs599839、rs646776及rs12740374基因型頻率，隨機(jī)選取第一部分DMPAD組中rs599839 AA、rs646776 AA及rs12740374 GG基因型各25例，另選擇rs599839A

19、G+GG、rs646776 AG+GG及rs12740374 GT+TT基因型各25例，其中每個(gè)位點(diǎn)的兩個(gè)基因型頻率比值與總DMPAD人群兩基因型頻率比值一致，檢測(cè)所選樣本SORT1 mRNA的表達(dá)。
　　3應(yīng)用SheSIS軟件進(jìn)行rs599839、rs646776及rs12740374的連鎖不平衡及單倍體型分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用 SPSS16.0軟件。不同基因型SORT1 mRNA表達(dá)情況比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05差異

20、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：1 DM組rs12740374與rs599839，rs12740374與rs646776， rs599839與rs646776之間的連鎖不平衡系數(shù)D'分別為0.933，0.977，0.930；r2分別為0.689，0.914，0.655。DM組3個(gè)位點(diǎn)間均存在連鎖不平衡。rs12740374與 rs646776之間連鎖不平衡程度最強(qiáng)；2 DMPAD組rs12740374與 rs599839，rs12740

21、374與 rs646776，rs599839與 rs646776之間的連鎖不平衡系數(shù)D'分別為0.915，0.959，0.922；r2分別為0.558，0.849，0.613。DMPAD組3個(gè)位點(diǎn)間均存在連鎖不平衡。rs12740374與rs646776之間連鎖不平衡程度最強(qiáng)；3 rs12740374，rs599839與rs646776單倍體型TGG頻率在DM及DMPAD組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）， OR值及95％CI為0.5

22、02（0.297-0.846）；4 rs12740374 GT+TT與GG基因型，rs646776 AG+GG與AA基因型，rs599839 AG+GG與AA基因型相比，SORT1 mRNA表達(dá)均升高，2-△△Ct值分別為5.81（3.07，11.00），3.94（1.64，9.44），2.36（0.73，7.62），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1年齡、HbA1C、TG、LDL-C、吸煙、高血壓、糖

23、尿病病程、冠心病、腦梗死是糖尿病PAD的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，而HDL-C是糖尿病下肢血管病變的保護(hù)因素。
　　21p13上位點(diǎn)rs599839AG+GG、rs646776 AG+GG、rs12740374GT+TT基因型是糖尿病下肢血管病變的保護(hù)因素。
　　3在顯性模型，總研究人群及糖尿病下肢血管病變?nèi)巳簉s599839、rs646776及rs12740374基因多態(tài)性與LDL-C呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。
　　4 rs12740374