胚胎WOW培養(yǎng)法的研究及應(yīng)用.pdf

1、手工克隆是近年來發(fā)展起來的一種新的核移植方法，由于整個(gè)過程不需要顯微操作，技術(shù)含量底，節(jié)省了操作時(shí)間，而且降低了成本，所以越來越受到專家們的重視。由于去除了透明帶，胚胎在致密化之前卵裂球之間容易相互分離，所以胚胎培養(yǎng)是手工核移植過程中最重要的一步。本實(shí)驗(yàn)利用檢卵針燒成圓球狀，在培養(yǎng)皿底燙制WOW，用來培養(yǎng)去透明帶胚胎。 實(shí)驗(yàn)1：為了探討本方法制作的WOW培養(yǎng)體系對(duì)胚胎發(fā)育的影響，本實(shí)驗(yàn)將牛無透明帶孤雌激活胚用此方法培養(yǎng)，驗(yàn)證此

2、培養(yǎng)體系是否適合培養(yǎng)牛無透明帶胚胎。將透明帶去除分3種情況：移入離子霉素之前去除，移入6-DMAP之前去除，移入培養(yǎng)液之前去除，可以驗(yàn)證無透明帶胚胎對(duì)離子霉素和6-DMAP敏感度的變化。本實(shí)驗(yàn)分別以5枚、15枚、30枚為一組，用WOW培養(yǎng)無透明帶孤雌胚證明胚胎數(shù)不同是否對(duì)其發(fā)育有影響。結(jié)果表明：各組的卵裂率(81.1％、78.9％和78.9％)與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)；移入6-DMAP中之前去除組的囊胚率(31.5％)與移入培

3、養(yǎng)液中之前去除組(32.4％)無顯著差異(P>0.05)，而且分別與對(duì)照組無差異顯著(P>0.05)；移入離子霉素中之前去除組未得到囊胚。移入6-DMAP中之前去除組囊胚細(xì)胞數(shù)(113.8±1O.1)與移入培養(yǎng)液中之前去除組囊胚細(xì)胞數(shù)(112.5±8.1)和對(duì)照組均無顯著差異(p>0.05)。分別5枚、15枚和30枚為一組進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)胚胎的后續(xù)發(fā)育無顯著影響。結(jié)論：本方法制作的WOW孔適合無透明帶胚胎的培養(yǎng)；利用離子霉素和6-DMAP激

4、活無透明帶卵母細(xì)胞時(shí)，要降低離子霉素的濃度或(和)作用時(shí)間，而2 mmol/L6-DMAP對(duì)無透明帶胚胎發(fā)育無影響；WOW培養(yǎng)法可以進(jìn)行少數(shù)胚胎的培養(yǎng)，提高胚胎的發(fā)育率。 實(shí)驗(yàn)2：收集卵母細(xì)胞853個(gè)，計(jì)算其成熟率。供體細(xì)胞消化不同程度(表面光滑的細(xì)胞和表面帶有毛刺的細(xì)胞)，重構(gòu)胚利用微滴培養(yǎng)法培養(yǎng)，看對(duì)融合率、卵裂率、囊胚率和囊胚細(xì)胞數(shù)的影響。將重構(gòu)胚移入WOW中進(jìn)行培養(yǎng)，四孔板的每個(gè)孔培養(yǎng)15枚，統(tǒng)計(jì)重構(gòu)胚的卵裂率，囊胚率

5、和囊胚細(xì)胞數(shù)。結(jié)果：成熟率較低(51.93％)；表面帶有毛刺的細(xì)胞作為供體細(xì)胞，其重構(gòu)胚融合率(79.9％)與表面光滑的細(xì)胞作為供體細(xì)胞(64.2％)相比，具有差異顯著性(P<0.05)，而在卵裂率、囊胚率和細(xì)胞總數(shù)上沒有差異顯著性(P>0.05)。利用WOW培養(yǎng)法培養(yǎng)重構(gòu)胚，與未用WOW培養(yǎng)法培養(yǎng)重構(gòu)胚相比，囊胚率有所提高，且具有差異顯著性(p<0.05)，而在卵裂率和囊胚細(xì)胞數(shù)方面沒有差異顯著性。結(jié)論：在挑選供體細(xì)胞時(shí)，可以挑選表面