線粒體抗氧化在老年大鼠心肌預處理早期保護中作用機制的研究.pdf

1、心血管疾病發(fā)病率高，嚴重威脅人類健康。目前，臨床上保護心肌的方法主要有：改善心肌灌注液成分、灌注方法、灌注溫度、缺血預處理、藥物預處理等。很多實驗室行之有效的心肌保護方法轉化到臨床使用時卻缺乏療效。有關臨床心肌保護方法的研究多數(shù)是在各種健康成年動物的心臟模型上進行的，而臨床病例卻經(jīng)常復合多種疾病和情況，“老齡”就是其中一個重要的影響因素。
　　由于老年心肌與成年心肌在形態(tài)、結構和功能上的差異，同一種心肌保護措施在成年與老年表現(xiàn)出的

2、效果卻不相同。老年心肌對缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）存在著易損傷傾向，目前臨床應用的心肌保護技術均被證實是不完善的，因此研究老年心肌保護防治策略有重要的理論意義和實用價值。
　　1986年Murry等首次提出缺血預處理（ischemic preconditioning，IPC），它是指反復短暫的缺血和再灌注可以提高組織對隨后一個較長時間缺血缺氧的耐受性。藥物預處理（pharmacology per

3、conditioning，PPC）的方法，是根據(jù)IPC機理，通過藥物激發(fā)或模擬機體內(nèi)源性物質(zhì)而呈現(xiàn)減弱I/R損傷的方法。Kerstion等提出吸入麻醉藥預處理（anesthetic preconditioning，APC）和IPC一樣，早期保護作用于預處理后立即出現(xiàn)1～3h后消失（第一窗），24h后出現(xiàn)第二窗保護作用（延遲時相）并可持續(xù)72h。本研究主要涉及預處理后第一窗保護作用。
　　我們選取老年大鼠為對象，利用大鼠心肌I/R模

4、型和成年大鼠心肌細胞模型，研究和比較預處理早期成年和老年大鼠心肌保護機制的不同特點。通過檢測Akt/GSK-3β信號通路的活性和線粒體滲透性轉換孔道（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）主要組成成分蛋白的相互作用關系，發(fā)現(xiàn)老年心肌預處理保護功能障礙與線粒體mPTP主要成分親環(huán)蛋白D（cyclophilin D，Cyp-D）表達的增高有關。并通過線粒體抗氧化處理降低了老年大鼠心肌

5、Cyp-D的表達，改善了老年大鼠預處理心肌保護作用。我們相信該機制是老年大鼠心肌易損性高的重要成因，為臨床老年心肌保護提供新思路和潛在治療靶點，可橫向推廣到其他相關疾病防治中。
　　第一部分、老年大鼠心肌預處理早期保護功能障礙和轉錄后調(diào)控機制有關。
　　長期氧化應激壓力使老年心肌在形態(tài)結構、功能和代謝等方面均不同于成年心肌，如逐漸加重的左心室肥厚、慢性心力衰竭、房顫。老年病人心肌在I/R和體外循環(huán)時更容易受損傷，適用于年輕心

6、肌保護方法并不能完全適用于老年心肌。
　　目的：調(diào)查成年大鼠和老年大鼠預處理后心肌信使 RNA（mRNA）表達的變化，驗證預處理的轉錄調(diào)控機制。
　　方法：采用大鼠心肌I/R模型，檢測心肌梗死面積和氧自由基（Reactive oxygen species, ROS）含量。通過基因芯片技術檢測mRNA表達的變化，并運用實時熒光定量PCR和免疫印跡技術證實mRNA的變化。
　　結果：老年大鼠APC后第一窗沒有心肌保護功能，

7、APC后成年大鼠心肌ROS含量增高，而老年大鼠ROS沒有增高。IPC后成年大鼠心肌Atf3、Egr1、IL6和Ccl2等mRNA表達增加，但是IPC后老年大鼠心肌mRNA沒有明顯改變，且APC對成年和老年大鼠心肌mRNA也無明顯改變。
　　結論：老年大鼠吸入麻醉藥預處理心肌保護功能障礙和異氟烷未能引出信號ROS的增高有關，參與預處理心肌保護作用涉及到轉錄后步驟。
　　第二部分、Akt/GSKβ信號通路調(diào)控線粒體滲透性轉換孔道

8、在老年大鼠預處理早期心肌保護中的作用。
　　線粒體是心肌I/R損傷的重要靶細胞器，mPTP是介導線粒體損傷的關鍵因素。Akt/GSK-3β信號通路在心肌保護中有重要作用，pGSK-3β通過與 ANT的結合抑制mPTP的開放，起到保護線粒體和維持細胞功能穩(wěn)定的作用。
　　目的：老年大鼠心肌預處理后Akt/GSK-3β信號通路的變化特點；是否能通過調(diào)節(jié)Akt/GSK-3β信號通路，改善老年大鼠心肌保護作用；Akt/GSK-3β信

9、號通路和mPTP的作用機制。
　　方法：采用電鏡比較成年和老年大鼠心肌 I/R損傷后線粒體超微結構變化特點，激光共聚焦顯微測定mPTP開放時間。免疫印跡檢測Akt/GSK-3β信號通路活性和mPTP成分變化。運用免疫共沉淀技術研究GSK-3β和mPTP各構成蛋白之間的結合率變化。
　　結果：成年大鼠在預處理后Akt/GSK-3β信號通路活化，線粒體水腫和腫脹減少，心肌得到保護。而基礎狀態(tài)老年大鼠該通路較成年大鼠活性增高，預處

10、理不能進一步激活該通路。老年大鼠分布于線粒體的pGSK-3β增多，與mPTP主要成分蛋白ANT結合增多，但由于老年大鼠心肌Cyp-D表達增高且易于和ANT結合，故mPTP開放時間較成年大鼠縮短。
　　結論：老年大鼠Akt/GSK-3β信號通路在生理狀態(tài)已經(jīng)被激活，預處理不能進一步激活該信號通路；且老年大鼠心肌線粒體Cyp-D表達增高，mPTP開放閾值降低，這些可能與老年心肌預處理功能失調(diào)有關。
　　第三部分、線粒體抗氧化通過

11、保護線粒體滲透性轉換孔道使老年大鼠獲得預處理早期心肌保護作用。
　　抗氧化治療被廣泛應用于臨床治療，但效果并不理想。重要的原因是很多抗氧化劑不能穿透細胞膜到達細胞內(nèi)發(fā)揮抗氧化效應。TEMPOL是一種新型膜通透性的兩性電解質(zhì)，和線粒體膜有高度親和力，進入線粒體后發(fā)揮SOD擬態(tài)作用。
　　目的：對老年大鼠進行線粒體抗氧化處理，觀測心肌和線粒體功能的改善，并探討其可以機制。
　　方法：線粒體抗氧化處理采取腹腔注射TEMPOL

12、125mg/kg/天，采用I/R模型觀測心肌梗死面積，并驗證預處理心肌保護作用。試劑盒測定GSH/GSSG，SOD活性，線粒體Ca2+攝取率驗證老年大鼠心肌易損性的變化。并用激光共聚焦顯微鏡測定mPTP開放時間的變化。
　　結果：4周線粒體抗氧化后，GSH/GSSG和SOD活性都明顯增高，免疫印跡顯示MnSOD表達增高，且Nitrotyosine的蛋白表達量下降。線粒體Ca2+攝取率恢復正常，mPTP開放時間延長，老年大鼠預處理早