七氟醚預(yù)處理對(duì)大鼠心肌的延遲性保護(hù)作用及其線粒體機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　 1.研究七氟醚預(yù)處理是否有延遲性心肌保護(hù)作用;
　　 2.探討線粒體ATP敏感性鉀通道（mito-KATP）和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)在七氟醚預(yù)處理的延遲性心肌保護(hù)作用中角色;
　　 3.觀察七氟醚預(yù)處理24小時(shí)后對(duì)大鼠心肌線粒體蛋白質(zhì)組的影響;
　　 4.電壓依賴性陰離子通道1(VDAC1)與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶(NADH-DH)在七氟醚預(yù)處理后的表達(dá)改變。
　　

2、研究方法研究分為四部分:
　　 1.七氟醚預(yù)處理是否有延遲相的減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用。健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組(n=12):假手術(shù)組(SHAM組)、缺血再灌注組（IR組）、七氟醚預(yù)處理后24h組（SEVO-24H組）和七氟醚預(yù)處理后48h組（SEVO-48H組）。SHAM組大鼠開(kāi)胸后左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)只套線，不結(jié)扎;IR組大鼠LAD結(jié)扎阻斷30min后再灌注120min; SEVO-24H組大鼠吸入2.5％

3、七氟醚60min，24h后建立心肌缺血再灌注模型;SEVO-48H組大鼠吸入2.5％七氟醚60min，48h后建立心肌缺血再灌注模型。每組6只大鼠分別記錄各組缺血前(T0)、缺血30min(T1)、再灌注30min(T2)、再灌注60min(T3)和再灌注120min(T4)時(shí)刻心率(HR)、平均動(dòng)脈壓(MAP)并計(jì)算心率收縮壓乘積(RPP);再灌注結(jié)束后取頸內(nèi)動(dòng)脈血測(cè)定肌鈣蛋白(cTn(l))，然后處死動(dòng)物，伊文氏藍(lán)和TTC染色法測(cè)心

4、肌梗死面積。每組另6只動(dòng)物于再灌注結(jié)束時(shí)電鏡下觀察各組心肌超微結(jié)構(gòu)，并取心臟左室檢測(cè)心肌ATP含量和分離線粒體檢測(cè)線粒體呼吸控制率(RCR);檢測(cè)心肌丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性;免疫印記法檢測(cè)心肌胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C(Cyto C)含量，以及心肌Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)，分離心肌線粒體觀察線粒體在200μM[Ca2-]環(huán)境下A520改變（提示線粒體腫脹程度），來(lái)判斷MPTP通透性改變。
　　 2.Mito-

5、KATP和MPTP在七氟醚預(yù)處理的延遲性心肌保護(hù)作用中角色。健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為11組(n=6)。假手術(shù)組（SHAM組）、缺血再灌注組（IR組）、七氟醚預(yù)處理組（SEVO組）、5-羥基癸酸（觸發(fā)）+七氟醚預(yù)處理組[5-HD(T)+SEVO組]、5-羥基癸酸（觸發(fā)）組[5-HD(T)組]、七氟醚預(yù)處理組+5-羥基癸酸（調(diào)節(jié)）+[SEVO+5-HD(M)組]、5-羥基癸酸（調(diào)節(jié)）組[5-HD(M)組]、蒼術(shù)苷（觸發(fā)）+七氟醚預(yù)處理組[A

6、TR(T)+SEVO組]、蒼術(shù)苷（觸發(fā)）組[ATR(T)組]、七氟醚預(yù)處理+蒼術(shù)苷（調(diào)節(jié)）組[SEVO+ATR(M)組]、蒼術(shù)苷（調(diào)節(jié)）組[ATR(M)組]。SHAM組開(kāi)胸不建立心肌缺血再灌注模型，IR組采取結(jié)扎LAD30min后再灌注120min建立在體心肌缺血再灌注模型，SEVO組在建立心肌缺血再灌注模型前給予2.5％七氟醚吸入共60min。5-HD(T)+SEVO組、5-HD(T)組、ATR(T)+SEVO組和ATR(T)組分別于

7、七氟醚（氧氣）吸入前10min給予5-HD(5 mg/kg)或者ATR(5 mg/kg); SEVO+5-HD(M)組、5-HD(M)組、SEVO+ ATR(M)組和ATR(M)組于LAD結(jié)扎前15min給予5-HD或者ATR。記錄缺血再灌注過(guò)程中血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)HR、MAP和計(jì)算RPP，再灌注結(jié)束時(shí)比較各組心肌梗死面積和血清肌鈣蛋白(cTn(l))水平，電子顯微鏡下觀察心肌超微結(jié)構(gòu)。
　　 3.觀察2.5％七氟醚預(yù)處理24小時(shí)后

8、對(duì)大鼠心肌線粒體蛋白質(zhì)組的影響。健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組(n=6)。假手術(shù)組(SHAM組)、缺血再灌注組（IR組）和2.5％七氟醚預(yù)處理組（SEVO組）。IR組大鼠采取結(jié)扎LAD30min后再灌注120min建立心肌缺血再灌注模型，SEVO組大鼠吸入2.5％七氟醚（共60min）24h后建立心肌缺血再灌注模型，SHAM組不建立IR模型。于再灌注120min后取心肌左室，采用差速離心結(jié)合密度梯度分離線粒體，雙向凝膠電泳法（2-DE）分

9、離線粒體蛋白質(zhì)，分析凝膠圖像后找出差異蛋白，并用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)鑒定差異蛋白，并用免疫印記法驗(yàn)證其中的兩個(gè)蛋白電壓依賴性陰離子通道1(VDAC1)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶(NADH-DH)。
　　 4.電壓依賴性陰離子通道1(VDAC1)與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶(NADH-DH)在七氟醚預(yù)處理后表達(dá)變化。健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為7組(n=12)。假手術(shù)組（SHAM組）、缺血再

10、灌注組（IR組）、七氟醚預(yù)處理組（SEVO組）、mitoKATPP阻斷劑5-HD(5 mg/kg)+七氟醚預(yù)處理組（5-HD+SEVO組）、活性氧清除劑2-MPG(20 mg/kg)+七氟醚預(yù)處理組（MPG+SEVO組）、單獨(dú)5-HD組和MPG組。5-HD組和2-MPG組均在七氟醚（或者氧氣）吸入前10min靜脈給予，每組6只大鼠于七氟醚（或氧氣）預(yù)處理后4h采用RT-PCR檢測(cè)心肌VDAC1和NADH-DH的mRNA表達(dá)。除SHAM組

11、外，其它各組大鼠于24h后采用結(jié)扎LAD的方法建立在體缺血再灌注模型，缺血30min后再灌注120min。再灌注120結(jié)束時(shí)檢測(cè)心肌梗死面積和血清cTn(I)，電鏡下觀察心肌超微結(jié)構(gòu)，Western blot法檢測(cè)心肌VDAC1和NADH-DH，以及Bcl-2和Bax表達(dá)。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.除SHAM組外，其它各組大鼠心肌缺血再灌注過(guò)程中HR、MAP和RPP均下降，但是各時(shí)間點(diǎn)組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0

12、.05）。與SHAM組比較，IR組心肌缺血再灌注后顯示明顯的心肌梗死面積和心肌cTn(I)釋放（P＜0.05)，電鏡下觀察到心肌形態(tài)改變提示心肌損傷嚴(yán)重。同時(shí)IR組線粒體功能明顯受損，包括線粒體RCR降低和心肌ATP含量明顯減少;心肌MDA含量增加而SOD活性降低;細(xì)胞漿Cyto C釋放增加，Bcl-2/Bax比率降低，而線粒體通透性增加（與SHAM組比較，P＜0.05)。而七氟醚預(yù)處理后24h和48h均能夠減少缺血再灌注后心肌梗死面積

13、和cTn(I)釋放，電鏡下觀察心肌損傷亦減輕（與IR組比較，P＜0.05）。七氟醚預(yù)處理24h和48h也能增加缺血再灌注后線粒體RCR和心肌ATP含量;降低MDA含量而增加SOD活性;減少細(xì)胞漿Cyto C，增加Bcl-2/Bax比率，降低線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放（與IR組比較，P＜0.05)。但是SEVO-24H組和SEVO-48H組比較，在減少心肌壞死和線粒體損傷方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 2.應(yīng)用2.5％

14、七氟醚預(yù)處理24 h后能夠減少心肌缺血再灌注后心肌梗死面積和心肌酶釋放，心肌超微結(jié)構(gòu)顯示損傷減輕（與IR組比較，P＜0.05)。在七氟醚預(yù)處理前或者在結(jié)扎LAD前給予mito-KATP阻斷劑5-HD，都將取消七氟醚預(yù)處理的作用，使心肌梗死面積和血清cTn(I)增加（與SEVO組比較，P＜0.05)。而只有在結(jié)扎LAD前給予MPTP開(kāi)放劑ATR才能取消七氟醚減少心肌損傷的作用（與SEVO組比較，P＜0.05)，在七氟醚吸入前給予ATR對(duì)心

15、肌梗死面積和血清cTn(I)沒(méi)有影響（與SEVO組比較，P＞0.05）。
　　 3.二維電泳后得到的凝膠分析顯示SHAM組、IR組和SEVO組分析的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)平均分別為615±8，634±13和611±9，其中表達(dá)差異大于或者等于1.5倍的點(diǎn)有21個(gè)。選取差異蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析，初步鑒定出15個(gè)蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)包括三羧酸循環(huán)相關(guān)酶如丙酮酸脫氫酶(PDH)，支鏈α-酮酸脫氫酶(BCKDH)，異檸檬酸脫氫酶(ICDH);電子傳遞連

16、相關(guān)成分包括NADH脫氫酶(NADH-DH)，細(xì)胞色素C脫氫酶(COX)，電子傳遞黃素蛋白(ETF)和ATP合酶;轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白類如電壓依賴性陰離子通道(VDAC)和線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)體(Tim9B);以及線粒體蛋白合成延長(zhǎng)因子(EFTu)。這些差異蛋白與能量的生成密切相關(guān)，除了BCKDH和EFTu外，這些蛋白質(zhì)在缺血再灌注損傷后表達(dá)減少，而七氟醚預(yù)處理能夠很大程度上挽回這些蛋白質(zhì)損失(P＜0.05)。七氟醚引起的線粒體蛋白質(zhì)組改變，整體上提示線

17、粒體能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)運(yùn)增加，有利于缺血再灌注后心肌能量的恢復(fù)。
　　 4.七氟醚預(yù)處理能夠減少心肌梗死面積與cTn(I)釋放（與IR組比較，P＜0.05），它的作用被預(yù)處理前給予5-HD和2-MPG取消（與SEVO組比較，P＜0.05）。七氟醚預(yù)處理后4h即發(fā)現(xiàn)VDAC1和NADH-DH的mRNA表達(dá)增加（P＜0.05），與SEVO組比較，5-HD+SEVO組和MPG+SEVO組的VDAC1和NADH-DH的mRNA水平均下降（P＜

18、0.05)。七氟醚預(yù)處理24h后心肌VDAC1和NADH-DH蛋白表達(dá)增加，而事先給予5-HD和2-MPG能夠取消七氟醚預(yù)處理引起的蛋白質(zhì)改變（P＜0.05)。
　　 研究結(jié)論:
　　 大鼠在體實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明:
　　 1.七氟醚預(yù)處理（2.5％吸入60min）具有延遲性心肌保護(hù)作用，能減少在體大鼠心肌缺血再灌注損傷后心肌壞死和線粒體損傷。
　　 2.Mito-KATP在七氟醚預(yù)處理延遲性心肌保護(hù)作用的觸