成纖維生長因子21和AdipoRon調控脂肪細胞分化及脂質代謝的機理研究.pdf

1、豬肉是我國人民主要消費的肉食品，然而隨著生活水平的提高，人們已經不滿足于溫飽，而是更傾向于高品質肉類的消費，對肉類的口感等提出了更高的要求?，F代分子生物學技術為尋找提高肌肉品質的重要基因或能夠改善肉質的靶標提供了有力支持。
　　成纖維生長因子21(FGF21)是一種肽類激素，由多個器官合成并參與調節(jié)能量代謝。令人興奮的是眾多研究表明FGF21具有對代謝有益的作用，這包括降低體重和改善血糖。在肝臟中，FGF21對調節(jié)禁食、高脂飼喂狀

2、態(tài)下脂肪酸氧化發(fā)揮很重要的作用。在白色脂肪組織中，FGF21參與糖代謝，并促進白色脂肪組織的棕色化。但是關于FGF21對豬肉的肌內脂肪的影響，以及對提高肌內脂肪含量的飼料添加劑的研究卻鮮有報道。AdipoRon是一種脂聯素受體激動劑，參與機體脂質代謝和能量代謝，提高機體胰島素敏感性，是治療胰島素抵抗相關疾病的一個候選藥物。本文重點研究了FGF21和小分子合成藥物AdipoRon對豬和小鼠模型中脂代謝的調控，主要結果如下:
　　1.

3、為了了解FGF21對肌內脂肪沉積的作用，我們利用“差速貼壁法”成功分離了豬原代肌內脂肪（intramucular fat，IMF）細胞，該細胞呈現長梭形，與成纖維細胞形狀類似。細胞狀態(tài)良好，細胞質內未發(fā)現肉眼可見的脂肪滴。
　　2.向生長狀態(tài)良好，并達到80％匯合的IMF細胞完全培養(yǎng)基中加入IBMX、DEX和胰島素，處理8天后前體脂肪細胞將逐步分化為成熟脂肪細胞。油紅O染色結果顯示大量細胞出現脂滴，并在油紅O的作用下呈現橘紅色，說

4、明IMF細胞已成功分離。
　　3.對原代肌內脂肪細胞實施穩(wěn)定轉染，并經過脂質體轉染和G418篩選，逐步出現了FGF21穩(wěn)定單克隆(FM)，實時定量PCR結果顯示穩(wěn)定轉染組細胞FGF21的mRNA水平顯著高于對照組，并且Western blot也表明穩(wěn)定轉染組細胞中FGF21的蛋白水平顯著提高。
　　4.通過對兩組分化處理后的細胞進行成脂分化處理，并對分化八天的細胞做油紅O染色。染色結果顯示經過八天分化后對照組細胞細胞質內出現

5、大量細小的脂肪滴，然而FM組細胞中脂肪滴明顯比對照組少。
　　5.為了研究成脂分化相關基因在FM組和對照組之間的表達差異，我們制備了這兩個組的cDNA文庫和細胞總蛋白。實時定量PCR結果顯示表達PPARγ基因的mRNA水平顯著低于對照組，并且對PPARγ表達起到關鍵作用的CEBPα和CEBPδmRNA水平顯著低于對照組;同時我們還檢測到了PPARγ和CEBPα的蛋白表達量顯著低于對照組。CEBPδ的mRNA水平并無差異，但是蛋白表

6、達量明顯低于對照組。同時參與PPARG mRNA表達的KLF2、SIRT1、SIRT2和FOXO1基因的mRNA水平無明顯差異，調控CEBPα表達的COUP-TFⅡmRNA無明顯變化。然而實驗組中KLF3的mRNA水平顯著高于對照組，而KLF5的mRNA表達水平顯著低于對照組。FAS和HSL之間的比值下調了，但未達到顯著水平，并且AGPAT和visfatin表達無差異。
　　6.FABP4和PLIN1的mRNA表達在FGF21超表

7、達組顯著降低，但是并沒有檢測到GLUT4和ADIPOQ mRNA的改變。Western Blot的結果證實了FABP4和ADIPOQ的蛋白顯著降低。然而FGF21對經典Wnt/β-catenin信號通路無顯著影響。而且FGF21也沒有改變CEBPα啟動子靠近轉錄起始位點區(qū)域(-172-+2bp)的甲基化水平（FM:control=1.1％:1.5％）。但是我們發(fā)現成脂分化相關轉錄因子CEBPβ通過結合到FGF21啟動子區(qū)域，抑制FGF2

8、1基因的轉錄。
　　7.與此同時，我們應用小鼠模型進一步研究脂聯素受體激動劑模擬物AdipoRon如何參與PPARα信號進而調控FGF21提高機體胰島素敏感性。數據表明低脂飼料飼養(yǎng)的C57BL/6小鼠在接受每天10mg/kg AdipoRon藥物處理10天后，體內脂肪的總體含量沒有變化，并且脂肪分解蛋白表達無差異。然而高脂飼料飼喂的C57BL/6小鼠在接受每天10mg/kg AdipoRon藥物處理10天后，白色脂肪組織中脂肪分解

9、相關蛋白的表達受到抑制，降低了血液中棕櫚酸和甘油的周轉速率。同時由于肝臟中來自脂肪酸β氧化的乙酰輔酶A含量的減少，降低了對丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC)的激活作用，從而減少內源性葡萄糖的產量。
　　8.通過提取兩組肝臟組織總蛋白，運用Western blot技術檢測蛋白表達水平，數據顯示AdipoRon激活了肝臟內PPARα信號通路，進而促進肝臟內FGF21的表達與分泌，上調血液濃度中FGF21濃度