山羊瘤胃原蟲與細(xì)菌吞噬關(guān)系和微生物AA變化機(jī)制的研究.pdf

1、瘤胃微生物蛋白質(zhì)是反芻動(dòng)物小腸氨基酸(AA)的重要組分。微生物的任何變化，如微生物的區(qū)系、AA-N比例、AA組成等的變化都將影響十二指腸AA的供給。在過(guò)去的研究和生產(chǎn)中一直認(rèn)為瘤胃微生物AA是恒定的。然而1992年Clark等綜合比較眾多研究者的研究結(jié)果提出了瘤胃微生物AA是可變化的觀點(diǎn)，此后至今，由于其對(duì)宿主不可或缺的重要性而使得微生物AA變化與否的論題一直為本領(lǐng)域研究與爭(zhēng)論的焦點(diǎn)。為此，本課題結(jié)合加vitro與in vivo法，并引

2、入熒光標(biāo)記細(xì)菌技術(shù)以及SSCP、克隆測(cè)序等分子生物學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)地探討微生物蛋白質(zhì)AA的變化規(guī)律及其機(jī)制，試驗(yàn)共分九個(gè)部分進(jìn)行。 試驗(yàn)1熒光標(biāo)記瘤胃細(xì)菌方法的建立和原蟲吞噬細(xì)菌速率的研究 以4只裝有永久性瘤胃瘺管的徐淮山羊提供的瘤胃液制備熒光標(biāo)記瘤胃細(xì)菌，用于瘤胃原蟲的攝食實(shí)驗(yàn)，研究山羊瘤胃原蟲吞噬細(xì)菌的速率。試驗(yàn)設(shè)置清洗原蟲祛除瘤胃自由細(xì)菌的熒光全標(biāo)組(WFLB)及未清洗原蟲保留瘤胃自由細(xì)菌的熒光標(biāo)記組(FLB)。結(jié)果表

3、明：WFLB組、FLB組吞噬速率分別為：398.40 cells/(cell h)、230.40 cells/(cell h)，換算為細(xì)菌N為：2.15 pg N/(cell h)、1.24 pg N/(cell h)；每天每頭山羊瘤胃內(nèi)蛋白微循環(huán)中細(xì)菌N循環(huán)量WFLB組、FLB組分別估計(jì)為：103.20 mg N/(d頭)、59.50 mg N/(d頭)，或者細(xì)菌蛋白循環(huán)量分別為0.645 g/(d頭)和0.372 g/(d頭)；結(jié)果

4、同時(shí)表明，熒光標(biāo)記技術(shù)可以應(yīng)用于瘤胃原蟲對(duì)細(xì)菌吞噬速率的研究。 試驗(yàn)2日糧精粗比對(duì)山羊瘤胃內(nèi)微生物蛋白質(zhì)微循環(huán)影晌的研究 本試驗(yàn)以4只裝有瘤胃瘺管的山羊，研究不同精粗比日糧對(duì)山羊瘤胃微生態(tài)中原蟲和細(xì)菌區(qū)系以及微生物蛋白微循環(huán)的影響規(guī)律。試驗(yàn)設(shè)置精(玉米-豆粕)：粗(稻草)分別為10：90、30：70、50：50、70：30的四種比例日糧(A、B、C、D)，采用4×4拉丁方設(shè)計(jì)進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，并結(jié)合熒光標(biāo)記瘤胃細(xì)菌技術(shù)測(cè)定瘤

5、胃原蟲對(duì)細(xì)菌的吞噬速率。 試驗(yàn)3精粗比對(duì)瘤胃發(fā)酵、原蟲種群結(jié)構(gòu)及吞噬速率的影響 在試驗(yàn)2的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究在不同精粗比例配合日糧條件下山羊瘤胃發(fā)酵、原蟲種群結(jié)構(gòu)以及吞噬速率的變化規(guī)律。結(jié)果表明：日糧精粗比對(duì)瘤胃發(fā)酵有影響。以30：70組微生物活力較強(qiáng)、NDF降解率較高、瘤胃pH值也相對(duì)波動(dòng)較??；精粗比對(duì)瘤胃原蟲結(jié)構(gòu)也有影響。50：50、70：30日糧組內(nèi)毛蟲和等毛蟲的比例顯著高于10：90、30：70組；而雙毛蟲和頭毛

6、蟲則相反。內(nèi)毛蟲與雙毛蟲和頭毛蟲的吞噬速率分別為361.90、606.30和607.50 cells/(cell h)，內(nèi)毛蟲的吞噬速率顯著低于雙毛蟲和頭毛蟲(P=0.000)，表明不同種屬原蟲吞噬細(xì)菌速率間有顯著差異，但隨日糧精粗比變化的規(guī)律基本一致?；貧w分析表明吞噬速率與日糧結(jié)構(gòu)間呈三次方的曲線關(guān)系(Y=-724.53X+563.15x2.124.666X3+646.833，RZ=0.97864)。另外，多元回歸分析表明吞噬速率與微

7、生物細(xì)胞密度有線性關(guān)系(R2=0.839)。方程為：Y=445.514.3.078X1+1.864X2(Y為吞噬速率；X1為細(xì)菌密度；X2為原蟲密度)。 試驗(yàn)4碳水化合物結(jié)構(gòu)對(duì)瘤胃發(fā)酵和微生物群體結(jié)構(gòu)的影響 以3只瘺管山羊作為瘤胃液供體，用體外法研究底物碳水化合物結(jié)構(gòu)對(duì)瘤胃發(fā)酵及微生物群體特征的影響。底物可溶性淀粉/纖維素比例為：100：0、70：30、50：50、30：70、0：100。結(jié)果表明：30：70組微生物產(chǎn)量

8、和纖維降解率最高，發(fā)酵狀態(tài)最佳；微生物蛋白產(chǎn)量與淀粉/纖維有三次方的曲線關(guān)系，細(xì)菌蛋白：Y=0.2410+0.0855X-0.0371X2+0.0029X3(R=0.7397)；原蟲蛋白：Y=0.2276+0.0853X-0.0380X2+0.0030X3(R=0.7370)。各組分別在8、16、24、24和24 h出現(xiàn)最大微生物產(chǎn)量(P<0.01)。另外，微生物AA-N比例在各組間也有顯著差異(P<0.05)。微生物區(qū)系原蟲與細(xì)菌的比

9、例總體上隨淀粉水平下降呈先上升后降低，以50：50組最高；而且PCR-SSCP圖譜反映了區(qū)系內(nèi)部類群因底物的改變而改變。原蟲分類計(jì)數(shù)結(jié)果表明隨淀粉水平的下降，內(nèi)毛蟲與等毛蟲的比例下降，而雙毛屬與頭毛亞科原蟲的比例增加，與SSCP的結(jié)果一致地表明其內(nèi)部類群的改變。對(duì)提取DNA的質(zhì)、量的檢測(cè)表明：微生物分離平均獲得率為53.29％；細(xì)菌DNA的提取率(45.40％)顯著低于原蟲(56.10％)(P<0.05)；微生物分離后DNA提取率為26

10、.13％；所提取的基因組DNA大小在20 kb以上，適合于后續(xù)研究的分子操作。綜合以上試驗(yàn)結(jié)果可認(rèn)為底物的變化引起了微生物發(fā)酵和其群系特征的變化，結(jié)果還證實(shí)PCR-SSCP適合于瘤胃微生物混合群體多樣性研究，同時(shí)也驗(yàn)證了ITS1區(qū)段是研究瘤胃原蟲的良好素材，從而基本確立了本課題瘤胃微生物群體研究的方法體系。 試驗(yàn)5不同分子形式氮源對(duì)瘤胃微生物蛋白產(chǎn)量和類群多樣性的影響 本試驗(yàn)的主要目的是研究不同分子形式氮源在人工瘤胃體外

11、培養(yǎng)條件下對(duì)瘤胃發(fā)酵、微生物蛋白合成和類群多樣性的影響。以3只瘺管山羊?yàn)榱鑫敢汗w，底物設(shè)計(jì)為：氯化銨、寡肽混合物(<3，000 Da)、小肽混合物(<500 Da)、游離氨基酸混合物。 試驗(yàn)6特定AA缺省對(duì)體外培養(yǎng)瘤胃微生物生長(zhǎng)限制性的研究 本試驗(yàn)采用底物移除法研究特定氨基酸在人工瘤胃體外培養(yǎng)條件下對(duì)瘤胃微生物生長(zhǎng)及其發(fā)酵特征的影響。以3只瘺管山羊作為瘤胃液供體，底物為：全量必需氨基酸組(A)，組氨酸(B)、賴氨酸(C

12、)、蛋氨酸(D)和支鏈氨基酸(E)的缺省組。結(jié)果表明：培養(yǎng)液pH值在5.90-6.80之間變化，均值以E組最高為6.54；培養(yǎng)液氨氮濃度變動(dòng)范圍為10.99-30.51 mg/100ml，均值以A組最高為17.85 mg/100 Inl：底物對(duì)微生物生長(zhǎng)的限制程度不同。以支鏈氨基酸缺省對(duì)微生物蛋白合成的限制最大，其細(xì)菌與原蟲及其微生物蛋白的產(chǎn)量皆最低(0.1389、0.1772和0.3 161 mg/ml) (P<0.01)，相對(duì)于A組

13、微生物蛋白下降了44.52％。底物對(duì)細(xì)菌和原蟲影響不同。原蟲與細(xì)菌比值以C組最低(89.12％)，E組最高(127.60％)(P<0.01)。同時(shí)底物還引起了微生物AA-N比例的變化(P<0.01)，以A組最低(16.89)，E組最高(18.76)。另外遺傳指紋分析提示微生物區(qū)系內(nèi)部類群也因底物而發(fā)生了變化。綜合以上試驗(yàn)結(jié)果可認(rèn)為特定氨基酸對(duì)微生物生長(zhǎng)及微生物發(fā)酵都有一定的影響。 試驗(yàn)7蛋白質(zhì)補(bǔ)充料對(duì)體外培養(yǎng)瘤胃微生物區(qū)系和發(fā)酵

14、的影響 本試驗(yàn)以不同蛋白質(zhì)補(bǔ)充料為底物進(jìn)行體外培養(yǎng)，主要探討蛋白質(zhì)補(bǔ)充料對(duì)瘤胃微生物發(fā)酵和區(qū)系特征的影響。試驗(yàn)采用3只瘺管山羊作為瘤胃液供體，底物為：A(羽毛粉)、B(玉米蛋白粉)、C(豆粕)和D(魚粉)。 試驗(yàn)8以4只瘺管山羊作為試驗(yàn)動(dòng)物，采用4×4拉丁方設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)。研究由羽毛粉(A)、玉米蛋白粉(B)、豆粕(C)和魚粉(D)等不同蛋白質(zhì)飼料配合的混合日糧對(duì)瘤胃發(fā)酵、微生物群體結(jié)構(gòu)、微生物蛋白(MCP)產(chǎn)量及其AA組

15、成模式的影響規(guī)律。在第一期正試期開始時(shí)分別從四只羊瘤胃中采集瘤胃液，用于相應(yīng)日糧作為培養(yǎng)底物的預(yù)先體外培養(yǎng)試驗(yàn)，以確保復(fù)雜與昂貴的體內(nèi)試驗(yàn)的有效性和必要性。結(jié)果表明，由不同蛋白補(bǔ)充料所配制混合飼料底物對(duì)瘤胃發(fā)酵、微生物類群結(jié)構(gòu)及AA-N影響與單純的蛋白補(bǔ)充料相比，在底物樣本間差異程度上雖然有所降低，但影響規(guī)律影響基本一致，并且微生物類群結(jié)構(gòu)及AA-N仍有明顯或顯著變化，表明進(jìn)一步開展體內(nèi)試驗(yàn)是必要和有意義的。 試驗(yàn)9繼而開展的1

16、04天的4x4拉丁方體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明：瘤胃液pH值在5.60-6.80之間變化，均值以A和C組較高，B和D組較低(P<0.05)，A和C、B和D的pH均值雖相近，但隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化模式相差較大；氨氮濃度變動(dòng)范圍為6.77-21.67 mg/100ml，均值以A組最低為11.08 mg/100ml，C組最高為15.04 mg/100ml，各組隨時(shí)間動(dòng)態(tài)變化模式也有所不同；日糧蛋白顯著影響MCP產(chǎn)量，以C、D組微生物蛋白較高，A、B組較低(

17、P<0.05)；雖然C、D組微生物蛋白相當(dāng)，但C組細(xì)菌蛋白產(chǎn)量卻顯著高于D組(P<0.05)。原蟲與細(xì)菌區(qū)系比例在組間差異顯著，豆粕組(81.27％)顯著低于其他三組(P<0.05)。進(jìn)一步克隆測(cè)序分析表明細(xì)菌中的類R．flavefaciens、R．bromii、Roseburia faecalis等8群系在組間差異顯著；原蟲中除Diplodinium外其他4類群都有顯著差異。微生物的AA-N比例在各組間也有顯著差異，并以C組最低，D組