絞股藍皂甙對山羊瘤胃菌群及微生物發(fā)酵特性和甲烷產(chǎn)量的影響.pdf

1、瘤胃生成的CH4是飼料能量的一種損失，同時也造成大氣環(huán)境的污染。因此，調(diào)控瘤胃發(fā)酵，減少CH4釋放，提高動物生產(chǎn)性能越來越受到重視。天然植物提取物皂甙具有抑制瘤胃原蟲生長，減少CH4產(chǎn)生的作用。開發(fā)植物皂甙調(diào)節(jié)瘤胃微生物發(fā)酵減少CH4產(chǎn)生及其對調(diào)控的機理的研究成為熱點。本試驗選用具有達瑪烷結(jié)構(gòu)三萜類植物提取物-絞股藍皂甙，分析其對瘤胃微生物體內(nèi)和體外CH4產(chǎn)量及對瘤胃微生物區(qū)系構(gòu)成和數(shù)量的影響，從微生物區(qū)系和數(shù)量的變化來闡述絞股藍皂甙減

2、少CH4產(chǎn)生的機理。并從耐受性試驗中，分析絞股藍皂甙減少CH4生成具有時效性的可能原因。為絞股藍皂甙在調(diào)控反芻動物瘤胃發(fā)酵，減少CH4生成中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 ⑴絞股藍皂甙對瘤胃微生物體外甲烷產(chǎn)量及發(fā)酵特性的影響。利用體外產(chǎn)氣量法研究絞股藍皂甙對瘤胃微生物CH4產(chǎn)量的影響。試驗包括兩個部分，試驗一研究了絞股藍皂甙對瘤胃微生物發(fā)酵的影響，試驗二分析絞股藍皂甙對瘤胃微生物發(fā)酵動力學參數(shù)的影響.試驗以0.42g羊草+0.126

3、g玉米+0.054g豆粕為發(fā)酵底物，絞股藍皂甙添加量分別為0(對照)、5、10、20和40mg/60mL，發(fā)酵24h。結(jié)果顯示，與對照組比較，各處理組CH4摩爾產(chǎn)量顯著下降(P<0.05)，CH4產(chǎn)量與皂甙之間有顯著的線性效應(yīng)。對氫的利用率僅有10mg組顯著低于對照組，其它試驗組無明顯變化。10mg絞股藍皂甙水平與對照組比較，顯著提高了TVFA產(chǎn)量及乙酸、丙酸和丁酸的比例(P<0.05)，乙丙比無顯著變化，乙酸，丁酸，異丁酸，戊酸，異戊

4、酸，支鏈脂肪酸百分比及乙丙比和TVFA濃度隨著皂甙劑量增加呈現(xiàn)顯著的二次方效應(yīng)，丁酸同時具有顯著的線性效應(yīng)。處理組原蟲數(shù)量顯著下降(P<0.05)，有著顯著的線性和二次方效應(yīng)(P<0.05)，而微生物蛋白含量沒有顯著變化，但呈現(xiàn)上升趨勢。高劑量皂甙組的氨態(tài)氮濃度顯著高于對照組(P<0.05)，與絞股藍皂甙之間有顯著的線性效應(yīng)。高劑量絞股藍皂甙降低了微生物發(fā)酵的理論產(chǎn)氣量與實際產(chǎn)氣量，并呈現(xiàn)顯著的線性和二次方效應(yīng)，產(chǎn)氣速率與皂甙之間有著顯

5、著的線性效應(yīng)。以上結(jié)果表明，絞股藍皂甙能改變瘤胃微生物發(fā)酵模式，提高VFA的生成，抑殺瘤胃原蟲，降低CH4產(chǎn)量，提高飼料能量利用效率，減少CH4釋放。
　　 ⑵絞股藍皂甙對山羊瘤胃微生物發(fā)酵及血液生化指標的影響。選用4只體重約為30±3kg的波爾山羊與本地山羊雜交的一歲閹公羊，采用4×4拉丁方試驗設(shè)計，分成4組，研究絞股藍皂甙對瘤胃發(fā)酵特性和微生物區(qū)系的影響。每天08:00和17:00進行飼喂，飼料為70％羊草和30％精料(玉米

6、：豆粕=7:3)。每天早晚分兩次經(jīng)瘤胃瘺管共向瘤胃中灌注0g(對照)，2g，4g和8g/d.h-1絞股藍皂甙。采食前0h和采食后2，4和8小時通過瘤胃瘺管負壓采集瘤胃內(nèi)容物。結(jié)果顯示，飼喂高劑量的皂甙后，瘤胃氨態(tài)氮濃度趨于顯著下降(P=0.057)，但對微生物蛋白、CH4產(chǎn)量及氫的利用無顯著影響(P>0.05)，但CH4產(chǎn)量有下降的趨勢，氫的利用率提高。乙酸、支鏈脂肪酸濃度及乙丙比略微下降，而采食量和丙酸濃度有所提高(P>0.05)。血

7、清中的血糖、甘油三酯、總膽固醇、血液尿素氮和總蛋白濃度無顯著變化(P>0.05).瘤胃原蟲總數(shù)及Entodinium spp.和Diplodinium spp.數(shù)量顯著線性下降。從瘤胃內(nèi)容物中提取基因組DNA，對微生物數(shù)量進行定量分析。產(chǎn)甲烷菌、真菌、黃化瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量以占總菌16s rDNA的比例來表示。產(chǎn)甲烷菌數(shù)量急劇下降，而真菌、纖維降解菌在低劑量2g/d.h-1條件下，與對照組比較比例顯著提高。在高劑量皂甙的添加

8、量下，幾種微生物的數(shù)量顯著下降。使用PCR/DGGE技術(shù)追蹤了瘤胃原蟲、細菌和產(chǎn)甲烷菌區(qū)系的變化，每只羊處理前后瘤胃原蟲區(qū)系的相似性在48-75％之間變化，產(chǎn)甲烷菌的相似性在66～87％之間。對7種原蟲上共生產(chǎn)甲烷菌的區(qū)系分析發(fā)現(xiàn)，不同原蟲上產(chǎn)甲烷菌區(qū)系結(jié)構(gòu)存在差異，且同種原蟲在絞股藍皂甙處理后，其共生產(chǎn)甲烷菌區(qū)系結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。切膠克隆測序發(fā)現(xiàn)原蟲上共同存在的優(yōu)勢產(chǎn)甲烷菌為產(chǎn)甲烷短桿菌(Methanobrevibacter sp.)。以

9、上結(jié)果表明，添加絞股藍皂甙影響瘤胃發(fā)酵，減少產(chǎn)甲烷菌、原蟲總數(shù)及單個種原蟲數(shù)量，促進兩種纖維降解菌及真菌的生長，改變了瘤胃微生物區(qū)系及與原蟲共生產(chǎn)甲烷菌的區(qū)系。
　　 ⑶瘤胃微生物的絞股藍皂甙耐受性研究。本試驗通過體外批次培養(yǎng)，分析多次傳代后，絞股藍皂甙對微生物發(fā)酵特性及細菌和產(chǎn)甲烷菌區(qū)系的影響。結(jié)果顯示，絞股藍皂甙提高了發(fā)酵體系的pH值，在對產(chǎn)氣量的影響上，除第1代5mg和10mg組產(chǎn)氣量高于對照組外，其它試驗組的產(chǎn)氣量與對照

10、組比較都有所下降，其中有些組的產(chǎn)氣量顯著或極顯著下降，并與絞股藍皂甙劑量之間存在顯著或極顯著的線性或二次方效應(yīng)。CH4產(chǎn)量下降，與皂甙劑量之間有顯著和極顯著的線性和二次方效應(yīng)(P<0.05或P<0.01)。氨態(tài)氮濃度均有所提高，MCP在第1代提高外，其它試驗組都與對照組相比有所下降，有些劑量和不同代次達到顯著或極顯著效應(yīng)。原蟲數(shù)量在第1和2代均顯著下降，與絞股藍皂甙添加量之間有顯著的線性效應(yīng)，到第3代原蟲數(shù)量很少，因此未做計數(shù)。絞股藍皂

11、甙明顯降低了VFA的濃度，乙酸，丙酸和丁酸濃度下降。添加皂甙后，細菌和產(chǎn)甲烷菌區(qū)系發(fā)生變化，優(yōu)勢條帶如溶纖維丁酸弧菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌在皂甙處理后消失，同時一些新的優(yōu)勢條帶如歐文氏菌和未知菌成為優(yōu)勢菌。這些變化表明，絞股藍皂甙能夠抑制一些微生物生長，同時，一些能夠適應(yīng)或降解絞股藍皂甙的微生物得以成為發(fā)酵體系中的優(yōu)勢菌群。以上結(jié)果表明，在多次傳代中，絞股藍皂甙改變了瘤胃微生物的發(fā)酵，微生物區(qū)系逐漸發(fā)生變化，以適應(yīng)有皂甙存在的生長環(huán)境。

12、r>　　 ⑷絞股藍皂甙對真菌與產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)甲烷的產(chǎn)量及發(fā)酵特性的影響。以青鏈霉素和氯霉素為抑制劑分別制備真菌與產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)(體系Ⅰ)及以真菌為主(體系Ⅱ)的兩種體外培養(yǎng)體系，研究添加不同劑量絞股藍皂甙對兩種培養(yǎng)體系CH4產(chǎn)量及體外發(fā)酵特性的影響。試驗結(jié)果表明：①在體系Ⅰ中添加絞股藍皂甙，CH4產(chǎn)量和產(chǎn)甲烷菌數(shù)量極顯著下降，與絞股藍皂甙劑量之間有極顯著的線性效應(yīng)(P<0.01)；產(chǎn)氣量和真菌數(shù)量極顯著下降，與絞股藍皂甙劑量之間有極顯

13、著的線性和二次方效應(yīng)(P<0.01)；TVFA和乙酸濃度顯著下降，并與絞股藍皂甙劑量之間存在極顯著的二次方效應(yīng)(P<0.01)；pH值顯著上升，并與絞股藍皂甙劑量之間呈極顯著的二次方效應(yīng)(P<0.01)。②在體系Ⅱ中添力口絞股藍皂甙，產(chǎn)氣量呈極顯的線性和二次方下降(P<0.01)；真菌和產(chǎn)甲烷菌數(shù)量呈極顯著的線性下降(P<0.01)；TVFA顯著下降(P<0.05)，乙酸極顯著下降，并與絞股藍皂甙劑量有顯著的線性和二次方效應(yīng)；pH值顯著