海洋微生物中細菌群體感應抑制因子的篩選與作用機制研究.pdf

1、隨著抗菌藥物的廣泛應用,細菌的耐藥性變得越來越嚴重,已成為全球關注的危害人類健康的重大難題。目前臨床上使用的抗生素都是以細菌的蛋白質合成、細胞壁合成、DNA超螺旋等為靶點,通過干擾這些重要生命過程直接殺死微生物或抑制微生物生長來實現(xiàn)抗感染目的的。在這種生存壓力下,細菌很容易產(chǎn)生耐藥性。顯然以傳統(tǒng)的靶點和篩選方法獲得的抗生素無法從根本上解決細菌的耐藥問題。因此,尋找治療細菌感染的新途徑已成為當今生命科學研究的前沿和熱點。近幾年來,細菌群體

2、感應(Quorum-Sensing,QS)研究的發(fā)展,給我們帶來了新的機遇和挑戰(zhàn)。群體感應是細菌根據(jù)細胞密度變化進行基因表達調控的一種群體行為。研究發(fā)現(xiàn),細菌通過群體感應系統(tǒng)調控致病過程的一些重要環(huán)節(jié),如致病因子產(chǎn)生、生物膜(Biofilm)形成等。根據(jù)美國NIH的調查報告,80％以上的細菌性感染與生物膜有關,而生物膜的形成是細菌產(chǎn)生抗生素耐藥性和免疫逃逸的主要原因之一。因此,細菌群體感應系統(tǒng)干擾的研究對于新型抗菌藥物的研究與開發(fā)具有重

3、要意義。本文以革蘭氏陰性菌的?；呓z氨酸內酯(N-acyl- homoserine lactones, AHL)介導的群體感應系統(tǒng)為靶標,從海洋微生物中篩選群體感應抑制因子,并對其活性和作用機理進行研究。綜合利用唯一能源法和報告菌株法,建立了一種從環(huán)境微生物中快速、高效地篩選能產(chǎn)生AHL群體感應抑制因子菌株的方法;利用該方法從海洋微生物中篩選得到多株具有AHL降解能力和競爭性抑制AHL群體感應能力的細菌,并對其中活性最高的一株進行了菌種

4、鑒定,命名為Stenotrophomonas sp.A8。構建了菌株A8基因組DNA文庫,利用AHL唯一能源培養(yǎng)基從文庫中篩選得到一個具有AHL降解活性的克隆,并利用亞克隆試驗確定了具有AHL降解酶活性基因的部分讀碼框;進一步通過反向PCR克隆得到該基因全長序列,最終得到的降解酶AQ1基因序列全長747bp,編碼248個氨基酸,分子量為31.2kD。與Pseudomonas aeruginosa中的AHL降解酶PvdQ同源性為12%,與

5、QuiP同源性為13%,可能屬于酰氨酶家族。該酶對多種不同碳鏈長度的AHL分子均具有降解活性,尤其對3OC6HSL降解活性最強。采用層析技術結合多種AHL報告菌株,從A8的發(fā)酵液上清中分離純化了三個具有AHL競爭性抑制作用的化合物,NMR和MS分析表明這三個化合物均為環(huán)肽,命名為:CP1、CP2和CP3。這三個化合物都能競爭性抑制AHL分子與其受體的結合;其中,CP2還能夠抑制革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌生物膜的形成;同時S

6、.aureus RN4220中QS調控基因agrA、SarA、Hld的定量PCR結果表明,其mRNA轉錄水平均受到CP2的抑制。因此,CP2的抗細菌生物膜形成作用可能是通過抑制S.aureus RN4220的QS系統(tǒng)來實現(xiàn)的。綜上所述,我們建立了一種高效的從環(huán)境微生物中篩選產(chǎn)生AHL群體感應抑制因子菌株的方法;從活性菌株Stenotrophomonas sp.A8中克隆了一個AHL降解酶基因,其重組酶具有降解多種不同碳鏈長度AHL分子的

7、活性,該類型的酶在Stenotrophomonas屬細菌中還未見報道;同時還從A8菌株發(fā)酵液上清中分離得到三個具有AHL競爭性抑制作用的環(huán)肽CP1、2和3,首次發(fā)現(xiàn)環(huán)肽化合物CP2對革蘭氏陽性菌表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌生物膜的形成具有顯著抑制作用,并初步證明CP2的抗生物膜作用與QS系統(tǒng)有關。與傳統(tǒng)的抗生素的作用機制完全不同,細菌群體感應抑制因子通過干擾細菌的群體感應系統(tǒng)實現(xiàn)抗感染的目的,而不影響細菌的生長,因此不會產(chǎn)生細菌耐藥性。