五節(jié)微生物中的轉(zhuǎn)座因子

1、第五節(jié)微生物中的轉(zhuǎn)座因子轉(zhuǎn)座因子（transposableelement，TE）是一類(lèi)廣泛存在于細(xì)菌、病毒和真核生物DNA分子中一段可自主改變自身座位的DNA片段，它可以在同一細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制子間轉(zhuǎn)移，也可以在一個(gè)復(fù)制子內(nèi)部轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)座因子是20世紀(jì)40年代由BarbaraMcClintock在進(jìn)行玉米的遺傳學(xué)研究時(shí)首先發(fā)現(xiàn)的，她因此而榮獲了1983年度的諾貝爾獎(jiǎng)。爾后在細(xì)菌中得到了廣泛和深入的研究。轉(zhuǎn)座因子的共同特征是：插入寄主DNA后

2、，導(dǎo)致基因失活；插入時(shí)在靶DNA位點(diǎn)產(chǎn)生一個(gè)短的正向重復(fù)順序。一轉(zhuǎn)座子的發(fā)現(xiàn)和分類(lèi)轉(zhuǎn)座因子：是基因組內(nèi)一段相對(duì)獨(dú)立的、可移動(dòng)序列，它們不必借用噬菌體或質(zhì)粒的形式就可以從基因組的一個(gè)部位直接轉(zhuǎn)移到另一個(gè)部位，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為轉(zhuǎn)（transposition）。轉(zhuǎn)座子每次移動(dòng)時(shí)攜帶著轉(zhuǎn)座必需的基因一起在基因組內(nèi)躍遷，所以轉(zhuǎn)座子又稱(chēng)跳躍基因（jumpinggene）。轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座特點(diǎn)（1）基因組內(nèi)移動(dòng)；（2）不依賴(lài)于供體與受體間的序列關(guān)系；（3）一

3、般僅移動(dòng)轉(zhuǎn)座子序列本身。根據(jù)轉(zhuǎn)座因子的轉(zhuǎn)座機(jī)理，將轉(zhuǎn)座因子分為兩類(lèi)：第一類(lèi)是DNA轉(zhuǎn)座子(DNAtransposon)，其轉(zhuǎn)座過(guò)程是從DNA→DNA，這類(lèi)轉(zhuǎn)座因子存在于原核生物和真核生物中，如細(xì)菌的轉(zhuǎn)座子和插入序列；第二類(lèi)是反轉(zhuǎn)座子(retrotransposon)，其轉(zhuǎn)座過(guò)程是以RNA為中間體，即從DNA→RNA→cDNA→DNA轉(zhuǎn)座。二、細(xì)菌轉(zhuǎn)座因子的類(lèi)型和結(jié)構(gòu)細(xì)菌轉(zhuǎn)座因子分為四個(gè)類(lèi)型：插入序列（ionsequence，IS）轉(zhuǎn)座子

4、（transposon，Tn）轉(zhuǎn)座噬菌體（Mu）接合型轉(zhuǎn)座子一）、插入序列插入序列也稱(chēng)IS因子，它是最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座因子。IS因子的長(zhǎng)度一般為0.72.5kb。?最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座因子，不含任何宿主基因的可轉(zhuǎn)座的DNA序列（ionsequencesIS）。?IS元件是獨(dú)立的結(jié)構(gòu)單位，每個(gè)元件只編碼為自身轉(zhuǎn)座所需要的蛋白質(zhì)。?IS元件的末端為短的反向末端重復(fù)序列（invertedterminalrepeats）。插入序列的結(jié)構(gòu)有以下3個(gè)特點(diǎn)：①在I

5、S的兩端含有長(zhǎng)度為10～40bp反向重復(fù)序列（invertedrepeatsequence，IR），兩端的反向重復(fù)序列在IS的切割和DNA鏈轉(zhuǎn)移中起作用。②大多數(shù)IS都含有一個(gè)編碼轉(zhuǎn)座酶（Transposnase簡(jiǎn)稱(chēng)Tnp）的長(zhǎng)編碼區(qū)，其啟動(dòng)子位于一端的反向重復(fù)序列之內(nèi)，而剛好終止于另一端的反向重復(fù)序列之前或之內(nèi)。轉(zhuǎn)座酶負(fù)責(zé)識(shí)別切割轉(zhuǎn)座子的兩端以及在靶位點(diǎn)造成切口。有些IS含有2個(gè)或2個(gè)以上的開(kāi)放閱讀框架，它們除編碼轉(zhuǎn)座酶外，還編碼用于

6、調(diào)控轉(zhuǎn)座酶活性的調(diào)節(jié)蛋白。③在IS插入時(shí)，在靶DNA位點(diǎn)產(chǎn)生一個(gè)短的、長(zhǎng)度一般為39bp正向重復(fù)順序(directrepeatsequence，DR)，分布在IS的兩側(cè)。?插入位點(diǎn)一般是隨機(jī)的，很少是位點(diǎn)專(zhuān)一的。?轉(zhuǎn)座是罕見(jiàn)事件，與自發(fā)突變率處于同一數(shù)量級(jí)，約為每代106一107。插入片段精確切離后，可使IS誘發(fā)的突變回復(fù)為野生型，但這種概率很低，每代只有106一1010。不精確切離可使插入位置附近的宿主基因發(fā)生缺失。二）、細(xì)菌轉(zhuǎn)座子幾

7、乎就在發(fā)現(xiàn)IS因子的同時(shí)，微生物學(xué)家和遺傳學(xué)家注意到細(xì)菌中某些對(duì)抗抗生素的基因能從一種DNA分子轉(zhuǎn)移到另一種DNA分子。因此，將帶有抗性基因并能在不同的DNA分子之間移動(dòng)的遺傳單位叫做細(xì)菌轉(zhuǎn)座子(bacterialtransposon，Tn)。Tn分子一般在2000~25000bp，兩端反向重復(fù)序列Tn與IS的主要區(qū)別是攜帶與轉(zhuǎn)座無(wú)關(guān)的藥物抗性或其他特性的基因。Tn一般具有抗生素抗性的基因，因?yàn)檫@些基因容易鑒別，故研究得較為廣泛和深入。

8、?某些Tn的反向重復(fù)序列是已知的IS，帶有IS的Tn也稱(chēng)為復(fù)合型轉(zhuǎn)座子，如Tn5、Tn10、Tn903?不含有IS的Tn稱(chēng)為簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子，如Tn3?沒(méi)有IS序列，體積龐大的轉(zhuǎn)座子稱(chēng)為T(mén)nA家族細(xì)菌抗藥性轉(zhuǎn)座子一般可分為兩類(lèi)：復(fù)合轉(zhuǎn)座子(compositetransposon)復(fù)雜轉(zhuǎn)座子(complextransposon)1.復(fù)合轉(zhuǎn)座子：復(fù)合轉(zhuǎn)座子是由兩個(gè)完全相同或類(lèi)似的插入序列IS和某種抗藥性基因組成的復(fù)合因子，IS作為T(mén)n的兩個(gè)臂或稱(chēng)

9、兩個(gè)末端，兩個(gè)IS在Tn中做正向或反向排列。在這類(lèi)轉(zhuǎn)座子中，IS可以帶動(dòng)整個(gè)Tn的轉(zhuǎn)座，也可單獨(dú)進(jìn)行轉(zhuǎn)座。?接合型轉(zhuǎn)座子在切割和整合上類(lèi)似于轉(zhuǎn)座子，但其機(jī)理不同于典型的轉(zhuǎn)座子如Tn5、Tn10：接合型轉(zhuǎn)座子可以形成ccc中間體，且整合部位不產(chǎn)生正向重復(fù)序列；?與質(zhì)粒相似，都能形成ccc轉(zhuǎn)移中間體，靠接合作用轉(zhuǎn)移，但不能獨(dú)立復(fù)制；?切割和整合上類(lèi)似于溫和噬菌體，其整合酶屬于λ整合酶家族，不同的是不形成病毒顆粒，不依賴(lài)于噬菌體進(jìn)行轉(zhuǎn)移。三、

10、細(xì)菌轉(zhuǎn)座因子的遺傳效應(yīng)和應(yīng)用一）、轉(zhuǎn)座因子的遺傳效應(yīng)轉(zhuǎn)座因子能引起許多遺傳變異，如插入突變和基因重排等。1.插入突變：各種IS、Tn都可以引起插入突變。當(dāng)它們插入到一個(gè)基因時(shí)，該基因的功能受到破壞，其表型和一般突變體相同，如營(yíng)養(yǎng)缺陷型、酶活性喪失等。另外，由于Tn總是帶有抗藥性基因，所以轉(zhuǎn)座子插入后除能引起基因突變外，還具有轉(zhuǎn)座子帶來(lái)的抗藥性。2.DNA重排(缺失、倒位和擴(kuò)增)：幾乎所有的轉(zhuǎn)座因子都能促進(jìn)它們相鄰基因的缺失。當(dāng)轉(zhuǎn)座因子插

11、入某一基因后，一方面引起該基因的失活，另一方面也引起插入部位鄰近片段的不穩(wěn)定而產(chǎn)生缺失。缺失：當(dāng)轉(zhuǎn)座子以相同方向轉(zhuǎn)座到鄰近位置上，在兩個(gè)正向重復(fù)轉(zhuǎn)座因子之間發(fā)生同源重組，就導(dǎo)致宿主染色體DNA缺失。倒位：當(dāng)轉(zhuǎn)座因子以相反方向轉(zhuǎn)座到鄰近位置上，然后發(fā)生重組，則引起染色體DNA倒位。擴(kuò)增：轉(zhuǎn)座子之間的同源重組，可使兩個(gè)不同的DNA片段連接在一起，從而引起DNA的擴(kuò)增。使一些原來(lái)在染色體上相距甚遠(yuǎn)的基因組合到一起，形成一個(gè)操縱子或表達(dá)單元，也

12、可能產(chǎn)生一些具有新的生物學(xué)功能的基因和新的蛋白質(zhì)分子。3.極性效應(yīng)當(dāng)轉(zhuǎn)座因子插入到一個(gè)操縱子的上游基因時(shí)，不僅能破壞被插入的基因，而且也能大大降低位于遠(yuǎn)離啟動(dòng)子一端的基因的表達(dá)。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)轉(zhuǎn)座因子都有極性效應(yīng)，而且正、反向插入都有這種現(xiàn)象。幾乎所有IS的可閱讀框內(nèi)(除IS1外)，都含有依賴(lài)于Rho的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和終止密碼子，這是造成極性突變的根本原因。極性效應(yīng)：一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位中的一個(gè)無(wú)義突變能抑制轉(zhuǎn)錄單位中隨后基因的轉(zhuǎn)錄。二）、轉(zhuǎn)座

13、子的應(yīng)用轉(zhuǎn)座子通常在一些被稱(chēng)為靶序列(targetsequence)的特定序列上插入，這些短序列在基因組上的排列是相對(duì)隨機(jī)的，它的插入導(dǎo)致被插入基因的突變。因此，可以利用轉(zhuǎn)座子的這一特性進(jìn)行基因誘變。用于誘變的轉(zhuǎn)座子一般都是復(fù)合型轉(zhuǎn)座子，如：Tn5、Tn9、Tn10等，其中用的較多的是Tn5和Tn10。它們的轉(zhuǎn)座頻率高，對(duì)目標(biāo)序列特異性要求低，而且轉(zhuǎn)座子不需要與細(xì)菌的基因組存在同源性等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛用于許多革蘭陰性菌的轉(zhuǎn)座誘變中。利用

14、轉(zhuǎn)座子可進(jìn)行隨機(jī)誘變和定位誘變。1.隨機(jī)誘變因?yàn)檗D(zhuǎn)座子不像質(zhì)粒那樣能獨(dú)立存在并自主復(fù)制，因此要利用轉(zhuǎn)座子進(jìn)行誘變時(shí)需要先將轉(zhuǎn)座子構(gòu)建在適當(dāng)?shù)妮d體上，通常所用的載體主要是質(zhì)粒。轉(zhuǎn)座子載體應(yīng)具有下面兩個(gè)功能：①能通過(guò)轉(zhuǎn)化或接合作用導(dǎo)人受體菌②在受體菌中不能自我復(fù)制，為自殺型質(zhì)粒載體，以使轉(zhuǎn)座子存在轉(zhuǎn)座壓力，保證通過(guò)抗性篩選得到的轉(zhuǎn)化子或接合子都含有轉(zhuǎn)座子。2.定位誘變?定位誘變與隨機(jī)誘變的原理類(lèi)似，但誘變中首先需要將轉(zhuǎn)座子，如Tn5，整合在

15、基因組上。?將要誘變的目的基因克隆到質(zhì)粒如F質(zhì)粒上。?將含有目的基因的F′質(zhì)粒轉(zhuǎn)入基因組已整合有Tn5的大腸桿菌中，再與受體菌雜交進(jìn)行誘變，最后篩選突變型接合子。3利用Tn5mob質(zhì)粒載體研究質(zhì)粒功能四、酵母中的轉(zhuǎn)座因子酵母轉(zhuǎn)座子Ty（Transposonyeast）與果蠅中的轉(zhuǎn)座子及反轉(zhuǎn)錄病毒原病毒類(lèi)似，能插入染色體的許多位點(diǎn)，在插入的Ty兩端靶基因產(chǎn)生5bp重復(fù)。Ty的轉(zhuǎn)座效率比細(xì)菌轉(zhuǎn)座子要低，約為107108。釀酒酵母中只有Ty因

16、子，而無(wú)其它種類(lèi)的轉(zhuǎn)座子。酵母菌是低等真核生物，其轉(zhuǎn)座子類(lèi)似于細(xì)菌轉(zhuǎn)座子。酵母轉(zhuǎn)座子中研究較清楚的是Ty類(lèi)轉(zhuǎn)座子：如TY1和TY917。TY結(jié)構(gòu)：含約5.6kb中心區(qū)，都有分布于兩端的340bp的同向重復(fù)序列(稱(chēng)為δ)，其作用與IS、Tn中的反向重復(fù)序列類(lèi)似。每個(gè)單倍體酵母基因組有3035個(gè)TY，及至少100個(gè)單一的δ因子(soloδelements)。Ty1轉(zhuǎn)座因子是通過(guò)一種RNA中間產(chǎn)物進(jìn)行的。首先以其DNA為模板合成一個(gè)拷貝的RN

17、A；然后再通過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成一條新的Ty1因子；最后這條新的Ty1轉(zhuǎn)座子再插入到新的位點(diǎn)上一）、Ty因子在酵母基因組中的分布情況釀酒酵母中有5類(lèi)反轉(zhuǎn)座子，即Ty1Ty5，Ty插入占整個(gè)基因組的3.1%，其中主要是單個(gè)LTR（soloLTR），是由于LTRLTR間的重組使Ty中間區(qū)缺少后產(chǎn)生的。二、Ty因子的分子結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄?酵母中5類(lèi)轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)基本相同，每一結(jié)構(gòu)單位約6.3kb，兩端是約330bp的長(zhǎng)末端正向重復(fù)序列LTR，中間是2個(gè)FTy

18、A和TyB；?TyA類(lèi)似于反轉(zhuǎn)錄病毒的gag，編碼結(jié)構(gòu)蛋白，如核酸結(jié)合蛋白（NA）；TyB類(lèi)似于pol，編碼參與反轉(zhuǎn)錄的酶蛋白，如蛋白酶、整合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、RNase等。?Ty因子從左側(cè)LTR結(jié)構(gòu)的啟動(dòng)子內(nèi)開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄出兩種mRNA：5kb、5.7kb（終止于右側(cè)的LTR內(nèi)）。?TyA和TyB以?xún)煞N方式表達(dá)：TyA蛋白代表TyA可讀框；TyB只有連接蛋白（TyATyB）的一部分被表達(dá)。Ty因子與反轉(zhuǎn)錄病毒非常相似（1）二者之間的分子結(jié)

19、構(gòu)非常相似，如均有長(zhǎng)末端重復(fù)序列LTR；它們轉(zhuǎn)錄和翻譯的方式也很類(lèi)似。（2）轉(zhuǎn)座是由Ty因子內(nèi)的基因控制的，且要經(jīng)過(guò)一個(gè)RNA階段。（3）雖然Ty因子不產(chǎn)生感染顆粒，但在經(jīng)誘導(dǎo)發(fā)生轉(zhuǎn)座的細(xì)胞中存在著Ty病毒樣顆粒（VLPsViruslikeparticles）（4）僅有某些Ty因子在任何酵母基因組中都有活性，大部分沒(méi)有轉(zhuǎn)座能力，此和惰性的內(nèi)源性前病毒相似。（5）反轉(zhuǎn)錄病毒首先被觀(guān)察到的是以傳染性病毒顆粒的形式存在，并能在細(xì)胞間傳播；而反