群體感應(yīng)抑制活性海洋微生物的篩選與抑制因子活性評(píng)價(jià).pdf

1、細(xì)菌耐藥性系指病原菌對(duì)于抗菌藥物作用的耐受程度,細(xì)菌產(chǎn)生對(duì)抗生素不敏感的現(xiàn)象。細(xì)菌耐藥性已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)重大難題。病原菌引起人體感染是其自身能夠產(chǎn)生多種毒力因子,許多病原菌毒力因子的產(chǎn)生都依賴于細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)和控制,實(shí)驗(yàn)證明群體感應(yīng)系統(tǒng)突變或缺陷的病原菌致病能力顯著下降,群體感應(yīng)抑制因子與傳統(tǒng)抗生素的作用機(jī)制不同,它不干擾細(xì)菌的正常生長(zhǎng),而是直接抑制病原菌的毒力因子的生成,因此,理論上能夠緩解細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。本研究

2、主要目的是從海洋微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物中篩選群體感應(yīng)抑制因子。
　　 本文利用銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)群體感應(yīng)篩選模型PAOMWI(pW-4)和紫色桿菌(Chromobacterium violaceum)群體感應(yīng)指示菌株CV026對(duì)海洋微生物發(fā)酵粗提物進(jìn)行活性測(cè)試,PAO MWI(pW-4)利用群體感應(yīng)調(diào)控基因lasB啟動(dòng)子和缺失啟動(dòng)子的蔗糖致死基因sacB構(gòu)建而成,外源加入信號(hào)分子和蔗糖能夠

3、誘導(dǎo)sacB表達(dá)殺死細(xì)菌,若存在抑制因子致死作用將會(huì)得到補(bǔ)救；信號(hào)號(hào)分子能夠誘導(dǎo)CV026產(chǎn)生紫色菌素,若有群體感應(yīng)抑制因子存在,紫色菌素產(chǎn)量將會(huì)降低。經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)1株放線菌和2株真菌粗提物具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制活性,其中菌株QY013抑制活性最強(qiáng),其18S rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),發(fā)現(xiàn)該菌株與Penicillium decumbens(斜臥青霉)進(jìn)化距離最近,相似性最高。目前,還沒有報(bào)道該類青霉種屬具有群體感應(yīng)抑制活性。對(duì)菌株Q

4、Y013進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),在其發(fā)酵培養(yǎng)液中分離得到活性單體化合物1個(gè),利用核磁(1HNMR,13C NMR)等方法鑒定其為-5,6二氫-4-甲基-2H-吡喃-2-酮,本研究首次證明該吡喃酮類化合物具有抑制銅綠假單胞菌和紫色桿菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的活性。在不影響細(xì)菌生長(zhǎng)的濃度范圍內(nèi),該化合物能顯著降低銅綠假單胞菌和紫色桿菌群體感應(yīng)調(diào)控的毒力因子,如彈性蛋白酶的活性、綠膿菌素產(chǎn)量,紫色菌素產(chǎn)量,抑制生物被膜的形成；RT-PCR技術(shù)證明該化合物能顯著降

5、低QS調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)水平。
　　 革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)信號(hào)分子在化學(xué)結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性,主要差別在于內(nèi)酯環(huán)上的脂肪酸碳鏈(C)長(zhǎng)度和飽和度,根據(jù)這種相似性和差別,我們對(duì)海洋化合物庫(kù)中的化合物進(jìn)行比較,利用篩選模型對(duì)18個(gè)與信號(hào)分子結(jié)構(gòu)相似的化合物進(jìn)行群體感應(yīng)抑制活性測(cè)試,發(fā)現(xiàn)4個(gè)化合物具有群體感應(yīng)抑制活性,編號(hào)HD-ZWM-242的化合物為已知化合物青霉酸,該化合物已有報(bào)道具有銅綠假單胞菌群體感應(yīng)抑制活性。編號(hào)HD-ZW

6、M-169的化合物能夠干擾銅綠假單胞菌和紫色桿菌兩種病原菌的群體感應(yīng)系統(tǒng),在非抑菌濃度范圍內(nèi),HD-ZWM-169能夠降低銅綠假單胞菌彈性蛋白酶的活性,綠膿菌素的產(chǎn)量,抑制紫色桿菌紫色菌素的生成,抑制銅綠假單胞菌Swarming運(yùn)動(dòng)性,RT-PCR驗(yàn)證該化合物能夠降低群體感應(yīng)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。
　　 本研究所發(fā)現(xiàn)的群體感應(yīng)抑制因子與傳統(tǒng)抗生素類藥物作用機(jī)理不同,只抑制病原菌群體感應(yīng)調(diào)控的毒力因子,但不會(huì)對(duì)細(xì)菌的正常生長(zhǎng)產(chǎn)生選擇