新型活性飼用微生物添加劑研制及生物活性評(píng)價(jià).pdf

1、微生物制劑以其無(wú)毒、無(wú)殘留、無(wú)耐藥性及低成本、可有效補(bǔ)充消化道有益微生物等諸多優(yōu)點(diǎn)，成為替代抗生素的理想制品之一，而被廣泛應(yīng)用。
　　本文從仔豬的糞便中分離鑒定的益生菌-蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)，又外購(gòu)了2個(gè)益生菌:鼠李糖乳桿菌（lactobacillus rhamnose）、戊糖乳桿菌（lactobacilluspentose）。以這3株細(xì)菌為研究對(duì)象，對(duì)3株益生菌分別進(jìn)行培養(yǎng)和發(fā)酵條件優(yōu)化，以期用廉價(jià)培養(yǎng)

2、基成分獲得到較高的活菌數(shù);然后對(duì)3株益生菌的穩(wěn)定性、抗逆性、菌種間的最佳配比及制得的微生物制劑的飼料酶活性進(jìn)行研究，研究了復(fù)合微生物制劑對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能、腸道定植和腸道菌群等的影響。獲得如下研究結(jié)果:
　　從待分離樣品中，經(jīng)分離、純化，生理生化鑒定和16S rDNA測(cè)序分析，分離到一株腸道益生菌-蠟樣芽孢桿菌。經(jīng)過(guò)安全性檢驗(yàn)可知，該菌株安全、無(wú)毒副作用，可作為制備微生物制劑的備用菌株。
　　采用單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)的方法對(duì)

3、分離篩選到的蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)及外購(gòu)的鼠李糖乳桿菌（lactobacillus rhamnose）、戊糖乳桿菌（lactobacillus pentose）分別進(jìn)行培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件優(yōu)化，獲得lactobacillus pentose最佳培養(yǎng)基配方為0.5％乳糖+0.5％廢糖蜜，0.5％棉粕粉，0.15％磷酸二氫鈉+0.15％磷酸氫二鈉;Bacilluscereus最佳培養(yǎng)基配方為0.5％蔗糖+0.5％廢糖

4、蜜，1％棉粕粉，0.1％氯化鈉;鼠李糖乳桿菌的最佳培養(yǎng)基配方為0.5％乳糖+0.5％廢糖蜜，0.5％棉粕粉，0.3％磷酸二氫鈉+磷酸氫二鈉。最優(yōu)發(fā)酵條件，即lactobacillus rhamnose最佳發(fā)酵條件為:發(fā)酵時(shí)間24h，起始pH為6.5，溫度為35℃，接種量5％，裝液量20％;蠟樣芽孢桿菌最佳發(fā)酵條件為:發(fā)酵時(shí)間28h，起始pH為7.5，溫度37℃，接種量7％，裝液量40％;鼠李糖乳桿菌最佳發(fā)酵條件為:發(fā)酵時(shí)間28h，起始p

5、H為7.0，溫度37℃，接種量7％，裝液量40％。最后，以各自優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件，活菌數(shù)分別達(dá)1.32×109 cfu/ml、1.15×109 cfu/ml和1.66×109 cfu/ml。
　　對(duì)3株益生菌的耐熱性、腸道耐受性及貯存穩(wěn)定性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，在65℃的條件下，蠟樣芽孢桿菌、鼠李糖乳桿菌和戊糖乳桿菌的存活率分別為92.54％、90.43％和87.01％，說(shuō)明3株益生菌均具有較好的耐高溫性質(zhì)。體外模擬動(dòng)

6、物腸道耐受性試驗(yàn)結(jié)果顯示，3株益生菌均能在pH為1.5的胃液中處理3h后保持106活性以上達(dá)，說(shuō)明3株益生菌均能夠在正常仔豬胃腸道中耐受較低pH;并且，3株益生菌均能在胰蛋白酶溶液處理3h后維持活菌數(shù)為108，在0.40％的膽汁溶液中維持活菌數(shù)在106以上，說(shuō)明，3株益生菌均能夠耐受胰蛋白酶溶液和胰蛋白酶溶液等消化酶的作用，完全可以耐受仔豬的胃液并進(jìn)入小腸發(fā)揮益生作用。貯存穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，加有保護(hù)劑（5％葡萄糖溶液）、-7℃（冷凍）

7、條件下貯存的菌粉穩(wěn)定性明顯高于其他組，90d后活菌數(shù)量仍保持在109 cfu/g水平。
　　通過(guò)急性毒理試驗(yàn)表明，以1∶1∶1比例混合的3株益生菌對(duì)小鼠一般體征、行為、活動(dòng)、毛發(fā)、色澤、飲食、糞便均未有明顯不良反應(yīng)，小鼠未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象;各組體重持續(xù)增長(zhǎng)，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組體重變化無(wú)顯著性差異(P＞0.05);肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和腎臟指數(shù)無(wú)顯著性變化，可初步判定混合益生菌無(wú)毒性。
　　通過(guò)將1∶1∶1混合的3株益生菌分別與大

8、腸桿菌（Escherichia coli）和沙門(mén)氏菌(salmonella)共培養(yǎng)，并采用3株接種時(shí)間（益生菌與有害菌同時(shí)接種、先接種益生菌后接種有害菌和先接種有害菌再接種益生菌）來(lái)驗(yàn)證3株益生菌對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑菌能力，結(jié)果表明，混合益生菌在三個(gè)接種時(shí)間均具有一定的抑菌效果。但混合益生菌先24h接種的效果要明顯好的多。而晚24h接種，仍然具有一定的拮抗效果，只是拮抗的時(shí)間要到48h效果明顯。并且，進(jìn)一步研究混合益生菌發(fā)酵液、發(fā)酵

9、濾液和菌體懸液抑菌功效表明，混合益生菌發(fā)酵液、發(fā)酵濾液和菌體懸液均可抑菌大腸桿菌和沙門(mén)氏菌，并且發(fā)酵液和發(fā)酵濾液的抑菌效果明顯優(yōu)于菌體懸液。
　　以1∶1∶1、1∶2∶1、2∶1∶2、1∶1∶2（依次為蠟樣芽孢桿菌、鼠李糖乳桿菌和戊糖乳桿菌）的比例混合3株益生菌，制得4種混合微生物制劑飼喂斷奶仔豬，研究各微生物制劑對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響。結(jié)果表明，飼糧中添加1∶1∶1的比例混合的微生態(tài)活菌制劑，在提高仔豬的生長(zhǎng)性能效果最顯著，并顯著

10、降低了腹瀉率。并且，添加混合微生態(tài)菌制劑的試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組的粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、鈣和磷均有提高，并且，每頭豬的經(jīng)濟(jì)效益還提升了16.194元。
　　對(duì)3株益生菌的產(chǎn)飼料酶-蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和β-甘露聚糖酶進(jìn)行了定性檢測(cè)。再以此為依據(jù)，對(duì)3株益生菌和1∶1∶1的比例混合的微生物制劑的產(chǎn)酶活性做了進(jìn)一步研究。結(jié)果表明，蠟樣芽孢桿菌的蛋白酶和淀粉酶的活性最高分別達(dá)到70.52U/ml和25.47 U/ml，且只有蠟樣芽孢

11、桿菌具有產(chǎn)甘露聚糖酶能力，酶活力為5.35U/ml;鼠李糖乳桿菌的纖維素酶活性最高，達(dá)4.06 U/ml。將3株益生菌混合制成的微生物制劑，制劑具有4種飼料酶的活性，雖然4種飼料酶活力均未達(dá)到單一菌株能夠達(dá)到的最高值，但各飼料酶均能檢測(cè)到活性，且活力較高，蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和甘露聚糖酶分別達(dá)到62.35 U/ml、21.67 U/ml、3.83 U/ml和5.21 U/ml。
　　應(yīng)用Real-time PCR方法準(zhǔn)確地對(duì)試

12、驗(yàn)期間仔豬糞便標(biāo)本中的3株特定益生菌進(jìn)行定量檢測(cè)。結(jié)果表明，喂食微生物制劑期間（28天），試驗(yàn)組中3株益生菌的數(shù)量多高于對(duì)照組(P＜0.05);在停喂微生物制劑兩周后，于42天時(shí)試驗(yàn)組仔豬糞樣中檢測(cè)出3株益生菌存在，且3株益生菌數(shù)量均超過(guò)斷奶當(dāng)日水平，表明3株益生菌均已定植在仔豬腸道內(nèi)。試驗(yàn)期間糞樣的pH研究表明，在對(duì)照組中，由于斷奶的影響，仔豬糞便pH呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，直到35 d后才逐漸恢復(fù);試驗(yàn)組仔豬糞樣pH始終較對(duì)照組低，且

13、基本保持在斷奶水平。說(shuō)明通過(guò)飼喂微生物制劑仔豬消化道保持偏酸性環(huán)境，可利于有益微生物的生長(zhǎng)和定植。
　　利用DGGE技術(shù)對(duì)斷奶仔豬糞樣中微生物菌群進(jìn)行跟蹤研究。結(jié)果顯示，飼喂微生物制劑可以通過(guò)在仔豬消化道內(nèi)定植來(lái)促進(jìn)腸道益生菌（雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌）的生長(zhǎng)繁殖，抑制有害菌（沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌）的生長(zhǎng)，從而達(dá)到調(diào)節(jié)腸道菌群的效果。并且，相似性結(jié)果顯示，對(duì)照組中，斷奶0和7d之間相似性最低，為38％，以后逐漸增加，7和28 d間